DBIO - Teses de Doutoramento / Doctoral Thesis
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- Development of novel insecticidal nanoformulations for plant protectionPublication . Frias, Jorge Miguel Vieira de; Simões, Nelson José de Oliveira; Reis, Rui Luís Gonçalves dosDurante vários anos, as pragas foram responsáveis por perdas nos produtos hortícolas, o que, consequentemente, teve um impacto significativo na oferta e qualidade dos alimentos e na evolução da sociedade humana. Embora os recentes avanços na ciência e na tecnologia tenham reduzido consideravelmente a incidência e a severidade causadas por pragas, uma grande parte da produção real ainda é perdida todos os anos. Por esta razão, a proteção das culturas agrícolas exige o controle de vários insetos praga de forma segura, eficaz e de baixo custo. Esse desafio pode ser uma oportunidade para os agentes de controle biológico uma vez que são alternativas mais seguras do que os pesticidas químicos usados atualmente. Desta forma, o objetivo desta tese foi produzir e formular moléculas biológicas conhecidas como fatores de virulência do nematode entomopatogénico da espécie Steinernema carpocapsae, para avaliar seu potencial uso como novos bioinseticidas contra insetos-praga. Esta investigação iniciou-se com a clonagem e a expressão heteróloga de duas proteínas putativas tóxicas do nematode, conduzidas em Escherichia coli, sendo estas um domínio proteico, designado de péptido ScK1 e a proteína Sc-CAP. A primeira referida assemelha-se aos bloqueadores de canais de potássio das anémonas do mar e a segunda faz parte de uma extensa família de proteínas que recebe o nome de CAP (Proteínas secretoras ricas em cisteína, antígeno 5 e proteínas 1 relacionadas à patogénese). Devido à complexidade dessas proteínas ricas em cisteína, só foi possível a produção bem-sucedida das recombinantes em fusão com a proteína chaperone designada por isomerase de ligação dissulfeto (DsbC). A estrutura secundária do péptido ScK1 que apresentou um tamanho molecular de 5.7-kDa, cujo a purificação indicou ser redox-sensível, exibiu um espectro de dicroísmo circular far-UV consistente com uma estrutura secundária alfa-helicoidal. A desnaturação térmica do péptido ScK1 permitiu estimar uma temperatura de desnaturação de 59,2 ± 0,1 ºC. A análise de interação proteína-proteína in silico revelou uma forte afinidade para com os canais de potássio dos insetos. Os resultados dos ensaios de toxicidade usando Drosophila melanogaster como modelo mostraram que a injeção deste péptido é letal contra insetos de forma dose-dependente, com uma dose letal média (LD50) de 52,29 ng por adulto. A administração oral da proteína de fusão reduziu significativamente a atividade locomotora dos insetos tratados após 48 horas do ensaio. A estrutura terciária predita da proteína Sc-CAP revelou uma conformação de alfa-beta-alfa com grande homologia com proteínas de outros nematodes parasitas de vertebrados, conhecidos por terem capacidade de ligação a esteróis. A versão recombinante apresentou um tamanho molecular estimado de 50 kDa e apesar da proteína não apresentar toxicidade por injeção ou administração oral, os experimentos de interação revelaram uma forte capacidade de ligação de esteróis. A análise de interação ligandoproteína mostrou uma alta afinidade do colesterol e do palmitato para diferentes motivos de ligação da proteína com uma energia de ligação de -6,3 e -4,5 kcal/mol, respetivamente. Estes resultados foram confirmados pelo ensaio in vitro, onde a proteína recombinante apresentou, de forma dose-dependente, grande afinidade de ligação ao colesterol. A Nanoencapsulação destas duas proteínas toxicas foi conseguida através da preparação de nanopartículas de quitosano pelo método de gelificação iónica. A caracterização geral das nanopartículas revelou um tamanho nanométrico para as formulações NanoScK e NanoCAP, com um tamanho médio de 182,0 e 676,9 nm, respetivamente, e uma liberação rápida inicial seguida por um perfil de liberação mais lento para ambas as formulações. Estas nanoformulações permitiram a libertação destas proteínas em insetos. Além disso, foi notável a acumulação dessas moléculas em diferentes tecidos do inseto, nomeadamente, no sistema digestivo e no sistema nervoso. A formulação NanoScK causou efeitos imediatos em insetos, induzindo uma evidente redução da atividade locomotora, paralisia e mortalidade, ao contrário do NanoCAP, onde se observou baixa mortalidade. Por fim, foram avaliados os efeitos dessas formulações sobre a progenia do inseto. NanoScK desencadeou uma redução significativa no número de ovos depositados por insetos tratados, enquanto o NanoCAP causou uma redução significativa na taxa de emergência de adultos. Os resultados desta tese conferem um estatuto de prova de conceito em relação ao uso de proteínas do secretado do nematode para o desenvolvimento de novas formulações inseticidas. Esta nova classe de biomoléculas pode dar origem à próxima geração de inseticidas biológicos visto que são específicos para as pragas alvo, biodegradáveis, não tóxicos, amigos do ambiente e de baixo custo de produção.
- Exploração dos recursos genéticos dos Açores para o desenvolvimento de uma enzima com aplicações na saúde: desenvolvimento de uma abordagem direcionada baseada em nanotecnologia (Enzyme4Thrombus)Publication . Lopes, Ivo Edgar Araújo; Simões, Nelson José de Oliveira; Gomes, Andreia Ferreira CastroAs doenças cardiovasculares, como a trombose, são a primeira causa de morte a nível mundial, sendo que a trombose resulta da ativação descontrolada da cascata fibrinolítica. Os agentes mais eficazes para o tratamento de doenças trombóticas são as enzimas fibrinolíticas. Neste âmbito, a enzima AprE127, produzida por um Bacillus subtilis isolado de amostras de solo da ilha de São Miguel, demonstrou ter atividade fibrinolítica específica, sem atuar como ativador do plasminogénio, possibilitando uma dissolução rápida e completa de trombos sanguíneos. Assim, o presente estudo teve como objetivo obter a enzima fibrinolítica AprE127 por expressão heteróloga, para possibilitar a sua produção em larga escala, e desenvolver uma nanoformulação baseada em lipossomas, para melhorar a entrega da enzima no organismo, reduzindo a possibilidade de reações imunológicas e de efeitos secundários. Para tal, desenvolveram-se, por tecnologia de DNA recombinante, duas versões da AprE127: a proteína AprE127 madura e a AprE127 sob a forma de pró-proteína. A expressão de ambas as versões da AprE127 foi testada em múltiplos vetores de expressão citoplasmática em E. coli, e em quatro linhagens celulares distintas (BL21, C41, Rosetta II e MC1061). Os resultados mostram que a proteína AprE127 madura foi expressa sob a forma insolúvel, em corpos de inclusão, mesmo no clone em que foi expressa em fusão com a enzima glutationa S-transferase (no vetor pGEX-4T-1), que não promoveu a solubilidade da AprE127. Apesar da proteína ter sido produzida em corpos inclusão, foram também obtidos bons rendimentos de produção médios de expressão (4 mg de proteína por litro de cultura) nos vetores pET23a(+) e pHTP1 (com otimização de codões para E. coli no caso do último vetor). De forma a obter a configuração funcional da proteína, esta foi desnaturada e renaturada a diferentes pHs, ambientes redox e força iónica, e com diferentes cofatores. Após os ensaios de desnaturação e renaturação da proteína madura, verificou-se que esta não adquiriu a conformação tridimensional correta, que lhe conferisse o nível de atividade proteolítica da proteína AprE127 nativa. Por outro lado, a proteína AprE127 foi obtida na forma solúvel, quando expressa sob a forma de pró-proteína, em fusão com as proteínas MBP ou SUMO. Não obstante, a expressão da pró-proteína solúvel apresentou um rendimento de produção médio mais baixo (1 mg de proteína por litro de cultura), e agravado pela necessidade de clivagem da proteína de fusão a jusante. A expressão heteróloga de ambas as versões da proteína AprE12 foi confirmada por Western-Blot e por espectrometria de massa. A proteína AprE127 madura foi incorporada na formulação patenteada de lipossomas DODAB/MO 1:2 (mol/mol), aproveitando as caraterísticas estruturais singulares do lípido monooleina, que potenciam a solubilização de proteínas. Estes lipossomas apresentaram características físico-químicas favoráveis à sua aplicação na entrega de fármacos, tendo tamanhos abaixo dos 200 nm e carga superficial positiva (entre os 40 e 60 mV). Estudou-se ainda a citotoxicidade dos lipossomas contendo a proteína recombinante madura, que demonstraram citotoxicidade dependente de dose. Desenvolveram-se adicionalmente lipossomas miméticos de exossomas, inovadores por mimetizarem a composição lipídica destas vesículas naturais, e que retêm algumas das suas caraterísticas desejáveis para aplicação na entrega controlada de biomoléculas, permitindo elevadas eficiências de encapsulamento e produção em larga escala, que o uso dos próprios exossomas não possibilita. Estes lipossomas apresentaram características físico-químicas favoráveis à sua aplicação por injeção intravenosa (tamanhos inferiores a 150 nm e carga superficial neutra), tendo também demostrado ser estáveis em condições fisiológicas, uma vez que não se verificaram alterações substanciais no tamanho, PDI e carga superficial após incubação em plasma humano. Este trabalho representou um primeiro passo para o desenvolvimento de uma tecnologia inovadora para o tratamento da trombose, recorrendo a um recurso natural dos Açores, i.e. a proteína AprE127, cujo potencial se encontrava ainda largamente inexplorado devido à sua baixa biodisponibilidade. Neste contexto, o recurso aos lipossomas nanométricos para encapsular a AprE127, permite potenciar a sua aplicação para a degradação de trombos sanguíneos.
- Tracking Machado-Joseph disease (MJD): identification of prodromal and early disease molecular biomarkersPublication . Ferreira, Ana Filipa Bartolomeu; Lima, Maria Manuela de Medeiros; Costa, Maria do Carmo Pereira daA doença de Machado-Joseph (DMJ) é uma doença neurodegenerativa de poliglutamina (poliQ) rara, causada pela expansão de uma repetição CAG no gene ATXN3 que codifica a proteína ataxina-3 (ATXN3). A DMJ é uma doença multissistémica de início tardio, envolvendo predominantemente os sistemas cerebeloso, piramidal, extrapiramidal, oculomotor e periférico. A ataxia da marcha é geralmente definida como o início da doença, por ser o sintoma inicial mais frequente (≈92%); no entanto, alguns doentes apresentam outros sinais/sintomas ainda antes das alterações da marcha, incluindo diplopia. A DMJ é caracterizada por uma longa fase pré-clínica durante a qual algumas manifestações clínicas não específicas, alterações no encéfalo e modificações moleculares já estão presentes, antes do aparecimento da doença. A ATXN3 é uma desubiquitinase, sendo que quer a proteína ATXN3 nativa quer a mutada são ubiquamente expressas em vários tipos de células de tecidos neuronais e não neuronais. A presença da expansão (CAG)n/trato poliQ expandido acima de um limiar patológico no transcrito/proteína ATXN3 inicia uma cascata de eventos patogénicos, os quais incluem a falhas na homeostasia celular, disfunção mitocondrial e stress oxidativo, alterações da apoptose, bem como desregulação transcricional. Algumas destas alterações moleculares têm potencial de serem usadas como biomarcadores da doença. Uma vez que as medidas clínicas atuais se revelam insuficientes para medir com rigor a eficácia de eventuais agentes terapêuticos modificadores da doença, em particular na fase pré-clínica, a identificação de biomarcadores para as fases iniciais da doença é extremamente importante no que diz respeito à sua monitorização da progressão, nomeadamente no contexto do desenvolvimento de terapêuticas. O principal objetivo desta tese é melhorar o conhecimento acerca das alterações moleculares associadas com a DMJ e contribuir para a identificação de novos biomarcadores transcricionais periféricos para a DMJ, particularmente nas fases iniciais da doença. No total, foram utilizadas amostras de RNA de sangue de 101 indivíduos molecularmente confirmados para a DMJ (20 indivíduos pré-clínicos, e 81 doentes incluindo 36 doentes da fase inicial – doentes com cinco ou menos anos de progressão) e 98 indivíduos controlo saudáveis dos Açores, bem como 20 doentes DMJ e 20 controlos saudáveis do Brasil. Foram também usadas amostras de cérebros post-mortem de doentes com confirmação molecular de DMJ (n=5) e de indivíduos controlo excluídos molecularmente para a DMJ (n=9); duas regiões severamente afetadas na DMJ (núcleos dentados do cerebelo e ponte) e uma região menos afetada (córtex frontal) foram analisadas. Foram também usadas amostras de sangue e cérebro (ponte e córtex cerebral) de ratinhos transgénicos YACMJD84.2 (n=11) e wild-type (n=11) de 9 meses de idade, assim como de amostras de cérebro (ponte e córtex cerebral) de ratinhos transgénicos (n=4) e wild-type (n=5) de 18 meses de idade. Uma caracterização demográfica, genética e clínica detalhada dos sujeitos DMJ açorianos confirmou que os indivíduos pré-clínicos já apresentam alterações antes do aparecimento da doença, tais como nistagmo e/ou disfagia; para além disso, na coorte total de doentes, e tal como seria expectável, a pontuação total da NESSCA (Neurological Examination Score for Spinocerebellar Ataxia) aumenta com a progressão da doença. No subgrupo de doentes da fase inicial com dois momentos de avaliação disponíveis, a análise dos subitens da NESSCA revelou que as alterações não cerebelosas desta escala deram o contributo principal para o aumento anual da pontuação total, indicando que ambos os parâmetros cerebelosos e não cerebelosos dos doentes DMJ são úteis para avaliar a progressão da doença, nas suas fases iniciais. Sendo a PCR quantitativa em tempo real a principal técnica experimental escolhida para avaliar a expressão transcricional, no âmbito deste trabalho, os genes a utilizar como genes de referência foram primeiro selecionados com base na sua estabilidade de expressão. Todos os cinco genes candidatos testados (PPIB, TRAP1, B2M, DECR1 e FPGS) mostraram expressão estável em amostras de sangue de indivíduos DMJ e controlos açorianos, indicando que todos eles podem ser usados para normalizar dados de PCR quantitativa em tempo real em estudos utilizando amostras de sangue de indivíduos DMJ; o TRAP1 foi identificado como o gene de referência mais estável de entre os cinco analisados. Para melhor elucidar o envolvimento da via mitocondrial da apoptose na patogénese da DMJ, foram analisados os níveis de expressão de três genes relacionados com este mecanismo (BCL2, BAX e TP53) em amostras de sangue e de cérebro post-mortem de indivíduos da DMJ e controlos. Os nossos resultados sugerem que a ativação da via mitocondrial da apoptose pode estar favorecida na periferia (amostras de sangue) dos indivíduos DMJ, tal como anteriormente reportado. Da mesma forma, os dados do cérebro post-mortem dos doentes DMJ mostraram que as células do córtex frontal, que se sabe estar pouco afetado na DMJ, podem ser mais vulneráveis a estímulos apoptóticos, enquanto as células nos núcleos dentados do cerebelo e ponte, que se sabem ser atingidas na DMJ, são mais propensas a sobreviver, sugerindo que as mesmas possam ativar mecanismos protetores de sobrevivência na fase final da doença. Com o objetivo de avaliar se os ratinhos transgénicos replicavam os resultados obtidos em indivíduos DMJ, analisou-se os níveis de expressão do Bcl2, Bax e Tpr53, e avaliou-se se a expressão destas moléculas variava com a progressão da doença. Os resultados indicam que quantidade das proteínas Blc2 e Bax está alterada no cérebro de ratinhos transgénicos pré-sintomáticos de 9 meses de idade e sintomáticos de 18 meses de idade, tendo estas alterações variado com a progressão da doença, indicando que a resposta das células a estímulos apoptóticos depende da fase da doença. Os nossos resultados indicam, ademais, que os ratinhos transgénicos de 18 meses de idade e os cérebros post-mortem DMJ estão em diferentes fases da doença. Com o objectivo de identificar novos biomarcadores transcricionais periféricos para a DMJ, utilizámos dados de um whole genome microarray realizado em amostras de sangue total de indivíduos DMJ e controlos, bem como dados disponíveis a partir de um estudo de expressão já realizado, tendo identificado os genes DDIT4, TRIM13 e P2RY13 como estando consistentemente desregulados em sangue de indivíduos DMJ em diferentes coortes (Açores e Brasil). Além disso, os níveis de expressão destes três genes correlacionam com características clínicas/genéticas dos doentes, sendo que quantidade das suas respetivas proteínas, estavam também alteradas nos cérebros dos doentes DMJ, ligando estas alterações transcricionais à patogénese da doença. É de salientar que os nossos resultados indicam que os níveis de DDIT4 e TRIM13 em sangue periférico possam constituir biomarcadores transcricionais fiáveis para a DMJ, em particular para as fases iniciais da doença. É ainda importante referir que o(s) mecanismo(s) da doença nos quais as proteínas TRIM13 e P2RY13 estão envolvidas – respetivamente, a eliminação de proteínas mal enroladas e agregadas durante o stress do reticulo endoplasmático, bem como a resposta inflamatória – aparentam estar mantidos no sistema nervoso central e na periferia (sangue) dos doentes DMJ. Globalmente o trabalho desenvolvido nesta tese demonstrou que os genes DDIT4 e TRIM13 são iomarcadores transcricionais periféricos em particular para as fases iniciais da DMJ; assim nós antecipamos que estes podem ser incluídos num conjunto de vários biomarcadores fluidos e/ou outros biomarcadores de neuroimagem e neurofisiologia para complementar as escalas clínicas para uma precisa monitorização da progressão da doença e medição da eficácia das terapias em ensaios clínicos. Analisando uma via que se sabe estar alterada na DMJ, este trabalho evidenciou também que diferentes regiões do cérebro têm uma vulnerabilidade específica à apoptose; tal foi verificado em amostras de indivíduos DMJ e de um modelo de ratinho DMJ.
- Unveiling the role of methylation prone (MP) and untranslated (UTRs) regions in the clinical variability of Spinocerebellar Ataxia Type 3(SCA3) /Machado-Joseph Disease (MJD): a genome-wide approachPublication . Melo, Ana Rosa Vieira; Lima, Maria Manuela de Medeiros; Bettencourt, Maria da Conceição FélixA Ataxia espinocerebelosa do tipo 3 (SCA3), também conhecida como doença de Machado-Joseph (MJD), é uma doença neurodegenerativa rara de manifestação tardia e pertencente ao grupo das doenças de poliglutamina (poliQ). O gene causal desta doença, ATXN3, apresenta como mutação causal a expansão do motivo repetitivo CAG. Este gene codifica a proteína ATXN3, uma proteína ubíqua que pode estar envolvida nos mecanismos de transcrição. As regiões não traduzidas (UTRs), 5’ e 3’ UTRs, juntamente com elementos cis-acting (tais como os promotores dos genes), são essenciais para a regulação da expressão génica. Além disso, também a metilação do ADN tem um papel importante na referida regulação. O principal objetivo desta tese de doutoramento foi analisar o impacto das regiões não traduzidas e das regiões propensas à metilação, na variabilidade clínica da SCA3. Para este efeito, estudámos a variação encontrada em 3'UTR do gene ATXN3 e analisámos o impacto destas variantes na variação da idade de início da doença nos doentes com SCA3. Reportámos nove variantes presentes em 3'UTR do gene ATXN3 que podem ter um papel na sua própria regulação génica. Na coorte Açoriana, composta por doentes com SCA3, nenhuma das variantes que foram identificadas apresentou um efeito modulador significativo na variação da idade de início da doença, e não fomos capazes de replicar os resultados para a variante rs709930 (e rs910369) obtidos por outro grupo de investigadores. Neste estudo, conseguimos identificar haplótipos associados à doença e que podem fazer a discriminação dos alelos expandidos; este facto pode ser relevante para o desenvolvimento de novas estratégias de allele-specific silencing. Estudámos também a variação encontrada nas UTRs de diferentes genes que foi obtida através da sequenciação alargada do exoma e efetuámos correlações genótipo- fenótipo para avaliar o impacto de tais variantes/genes na variação da idade de início dos doentes com SCA3. Neste estudo identificámos quatro genes candidatos a modificadores da variação da idade de início da doença: GLI4, TGFA, ERBB4 e MPHOSPH9. Os alelos alternativos das variantes no gene GLI4, apresentaram uma modificação prevista nos locais de ligação dos factores de transcrição e nos factores de transcrição, que se ligam a esses locais; este gene apresentou ainda uma variação na idade de início da SCA3 de três anos (a idade de início é mais tardia). Os restantes genes modificadores (TGFA, ERBBB4 e MPHOSPH9) identificados neste estudo, apresentam variantes em 3’UTRs, são conhecidos como interatores do gene ATXN3, e influenciam significativamente a variação na idade de início da doença. Também conseguimos obter oito pathways estatisticamente enriquecidas, duas delas contendo genes com efeito modificador (TGFA e ERBBB4): HIF1α Signaling e Neuregulin Signaling. Estas pathways podem ser importantes para outras aplicações terapêuticas nesta doença. Por fim, efetuámos um estudo piloto de metilação genome-wide. Tanto quanto nos é possível saber, este é o primeiro estudo que investiga as alterações de metilação do ADN em doentes com SCA3 e em controlos emparelhados. Como o tamanho da amostra foi pequeno, não esperávamos a ocorrência de CpGs diferencialmente metiladas, entre doentes e controlos. A análise de enriquecimento da lista de 1279 genes que obtivemos, mostrou um enriquecimento para pathways envolvidas em doenças neurodegenerativas, tais como a Calcium signaling pathway. Também realizámos uma análise com epigenetic clocks (Hannum e Horvath) para doentes com SCA3 e controlos emparelhados. Não conseguimos encontrar diferenças entre doentes e controlos para a idade de metilação do ADN, para ambos epigenetic clocks . No caso da diferença da idade de metilação do ADN e a diferença da idade de metilação residual do ADN, também não fomos capazes de encontrar diferenças entre os dois grupos para ambos os epigenetic clocks. Estes resultados podem ser explicados pelo tamanho da amostra e pelo poder limitado deste estudo. Esta tese de doutoramento tentou contribuir para a descoberta do papel das regiões não traduzidas e às regiões propensas à metilação na variabilidade clínica da SCA3. Para este efeito, obtivemos: a) variantes com impacto previsto em 3'UTR do gene ATXN3; b) genes candidatos a modificadores, com variantes em UTRs; c) nenhum resultado significativo para o primeiro estudo a nível do genoma sobre a metilação do ADN, comparando doentes e controlos; serão necessários mais estudos, num número maior de doentes e controlos para obter um perfil de metilação para a SCA3.
- Near real-me distribution modelling of cetacean distribution off the AzoresPublication . Morcillo, Marta Tobeña; Juliano, Maria Manuela Fraga; Silva, Mónica Cordeiro de Almeida; Lehodey, PatrickOs cetáceos têm habitado o Oceano Atlântico desde há muito tempo, e a comunidade açoreana tem dependido deles por séculos. No início do último século, a comunidade açoreana eram balieiros, mas depois da moratória de caça de baleias, o negócio do turismo cresceu a volta dos cetáceos. Além disso, os cetáceos têm um papel essencial no meio ambiente, sustentando à integridade do ecossistema marinho. Os processos que guiam a sua presença nos Açores são complexos e identificá-los é um reto. Há múltiplas opções: processos ecológicos, atividades antropogénicas, o a mistura deles. Encontrar as relações entre cetáceos y os seus geradores de presença é essencial para predizer como as alterações no ambiente e das atividades humanas podem influir na resiliência de grupo e no serviço deles ao ecossistema.
- Mapping deep-sea biodiversity and good environmental status in the Azores: assisng with the implementaon of EU Marine Strategy Framework DirecvePublication . Taranto, Geral Hechter; Menezes, Gui Manuel Machado; Gomes, Telmo Alexandre Fernandes MoratoABSTRACT: One of the major shortfall of biodiversity knowledge steams from an incomplete description of the geographical distribution of species. Overcoming this shortfall is essential for conserving nature and its services and it is a required first step to tackle more complex ecological processes (e.g. dispersal, speciation, disturbance, biotic interactions, etc.) in remote and poorly studied regions such as the deep sea. In a region such as the Azores (NE Atlantic), where the deep sea represents a dominant component of the seascape, it is essential to characterize patterns and processes of deep-sea biodiversity. In fact, only by understanding how species and marine resources distribute it is possible to correctly inform area- and ecosystem-based management and achieve the goals of policies aiming at reversing the cycle of decline in ocean health. In particular, the European Commission has adopted a number of policies to grant a sustainable use of nature space and resources which include the Marine Strategy Framework Directive (MFSD) and the Maritime Spatial Planning Directive (MSPD). The overall goal of this thesis is to bring together existing and new biodiversity data from recent scientific surveys to deepen our understanding of biodiversity and biogeographic patterns of deep-sea Vulnerable Marine Ecosystems (VMEs) indicator taxa. The focus is on deep-sea hard-substrate communities of the Azores and, in particular, on ecosystem engineer species of the Phyla Cnidaria and Porifera. Four major environmental drivers of deep-sea benthic engineer species are recognized in the Azores: (i) a latitudinal gradient in primary production strongly influenced by the Azores Current-Azores Front (AzC-AzF) system; (ii) the depth-wise succession of the regional water masses and their stratification into different isopycnal (vertical) layers; (iii) the spatial distribution of prominent geomorphic features such as seamounts ridges and island slopes; (iv) the availability of hard substrate for attachment. The recognition of these environmental drivers sets an interesting background for future ecological research, ecosystem-based management and spatial monitoring. The response of deep-sea species to these environmental drivers is explored in detail in the different chapters of the present manuscript.
- Impacte da alga invasora Asparagopsis armata nas comunidades litorais dos AçoresPublication . Prestes, Afonso Costa Lucas; Neto, Ana Isabel de Melo Azevedo; Azevedo, José Manuel Viegas de Oliveira Neto; Cacabelos, Eva; Martins, Gustavo Oliveira de MenezesAs invasões biológicas ocorrem quando uma determinada espécie chega a um local fora de sua área natural de distribuição, expande‐se e passa a ser dominante, constituindo populações autossustentáveis. Quando a espécie ameaça a diversidade biológica do local onde se deu a sua chegada, diz‐se que se trata de uma espécie invasora. A taxa de sucesso da chegada e fixação de novas introduções está dependente de vários vetores, estando o aumento das invasões marinhas registado nas últimas décadas maioritariamente relacionado com o aumento do transporte comercial marítimo e a expansão da aquacultura marinha, actividades que têm contribuído sobremaneira para a transferência de espécies entre diferentes áreas e regiões geográficas. Os processos que facilitam ou inibem a taxa de sucesso das invasão marinhas, bem como a previsão do seu potencial impacte tanto ao nível ecológico, como comercial, são ainda pouco compreendidos. Não obstante, o aumento registado no número de espécies invasoras associado às alterações climáticas é apontado como uma das principais ameaças aos sistemas costeiros, com repercurssões difíceis de prever ao nível da estrutura e funcionamento das comunidades marinhas. Este estudo teve como objectivo investigar o potencial impacte da alga não nativa Asparagopsis armata nos Açores, prever processos de facilitem ou limitem a sua distribuição bem como prever o efeito expectável do aquecimento dos oceanos no seu metabolismo. Neste âmbito, desenvolveram‐se as seguintes tarefas: (1) avaliação das alterações ocorridas a longo prazo nas comunidades algais do litoral da ilha de São Miguel, comparando a estrutura atual com a de há vinte anos; (2) avaliação do potencial efeito das áreas marinhas protegidas nos padrões de distribuição da comunidade algal com enfoque nas espécies A. armata e A. taxiformis; (3) investigação do potencial efeito de macroherbívoros marinhos (ourços e peixes) na comunidade algal de pouca profundidade com enfoque na distribuição de A. armata; (4) comparação da fauna associada a A. armata, A. taxiformis e uma espécie nativa abundante nos Açores, Halopteris scoparia; e (5) avaliação da variação da produtividade e parâmetros fotossintéticos de Asparagopsis spp. e Falkenbergia sp. a diferentes temperaturas. A análise comparativa da estrutura das comunidades algais entre os dados históricos (≈20 anos) e os dados atuais revelou diferenças significativas e consistentes tanto ao nível da composição como da estrutura das comunidades algais, salientando‐se o decréscimo substancial e generalizado na abundância da maior parte dos grupos de algas, entre as quais A. armata. Foi detetado um efeito positivo das Áreas Marinhas Protegidas (AMP) na diversidade das comunidades algais, embora não se tenha registado qualquer efeito ao nível da alga invasora A. armata. O estudo da herbivoria na distribuição de A. armata foi limitado, tendo a experiência sido afetada pela existência de artefactos relacionados com a manipulação experimental que impossibilitaram uma clara interpretação dos resultados. A comparação do biota associado às três espécies de macroalgas examinadas revelou que a alga nativa H. scoparia suporta abundâncias inferiores, mas números de taxa maiores ou semelhantes aos associados às invasoras A. armata e A. taxiformis. Ou seja, H. scoparia revelou suportar uma maior densidade de espécies de macrofauna associada do que o género Asparagopsis. A resposta ao nível da produtividade e dos parâmetros fotossintéticos entre os três taxa testados (A. armata, A. taxiformis e Falkenbergia sp.) foi variável para as diferentes temperaturas testadas. De uma forma geral, os resultados revelaram a elevada adaptabilidade de A. taxiformis a variações no intervalo de temperaturas investigado.
- Linking climate, distribuon and growth in forest research: can dendrochronology improve species distribuon modelling?Publication . Pavão, Diogo Cláudio; Silva, Luís Filipe Dias e; Silva, Lurdes da Conceição Borges; Elias, Rui Miguel Pires Bento da SilvaEstudos em dendrocronologia são mais escassos em áreas com humidade relativa alta, baixa amplitude térmica e sazonalidade pouco pronunciada. Por isso, esta lacuna de conhecimento cria uma oportunidade para explorar os anéis de crescimento de espécies arbóreas da floresta Laurissilva e montana dos Açores. Esta trabalho teve como objetivo reduzir esta lacuna e compreender melhor o papel da dendrocronologia na modelação ecológica, sendo que para tal, foram recolhidas mais de 900 amostras de madeira de três espécies arbóreas nativas dos Açores: Juniperus brevifolia (Seub.) Antoine (Cupressaceae), Ilex azorica Gand. (Aquifoliaceae) e Laurus azorica (Seub.) Franco (Lauraceae). Dez diferentes locais foram escolhidos em duas ilhas, São Miguel e Terceira, e foram aplicados métodos padrão da dendrocronologia e dendroclimatologia, que incluem o alinhamento, detrending e exclusão de amostras ou porções de cronologias. Várias opções de modelação (por exemplo, Modelos Lineares Generalizados e Random Forest) foram usadas para determinar os principais fatores climáticos que afetam o crescimento radial das árvores. Todas as três espécies estudadas mostraram alguns limites de anéis parcialmente indistinto. No entanto, após a aplicação rigorosa de métodos dendrocronológicos, mostraram um potencial aceitável para investigação em dendrocronologia. A madeira de J. brevifolia apresentou uma distinção de cores entre o alburno (tons amarelados) e o cerne (tons avermelhados). No I. azorica, foi encontrada uma linha de vasos associada à fronteira dos anéis na maioria das amostras. Ambas as cronologias maiores e mais pequenas foram encontradas para o I. azorica, respetivamente nas Sete Cidades com 47 anos de comprimento e na Terra Brava com 128 anos. Diversas relações foram encontradas entre o crescimento das árvores e temperatura, principalmente um efeito positivo da temperatura da primavera (I. azorica e L. azorica) e efeito negativo das temperaturas de verão (todas as três espécies). A precipitação da primavera também afetou o crescimento radial do I. azorica. O clima do ano anterior foi também relevante no crescimento das árvores do I. azorica e L. azorica, indicando efeitos fisiológicos tardios. Nos Açores, as limitações nos estudos de dendrocronologia estão relacionadas com a baixa amplitude térmica entre estações do ano, com a sazonalidade pouco pronunciada, e com a elevada variação dos padrões dos anéis de crescimento. A variação encontrada entre as populações está relacionada com perturbações naturais (elevação, diferenças de solo e processos de sucessão e regeneração) ou antropogénicas (corte de árvores e plantação de espécies exóticas). Ambos, são fatores que influenciam os diferentes comprimentos das cronologias construídas e das pequenas variações das relações de clima-crescimento. Os resultados globais sugerem que, no futuro, ao usar ferramentas dendrocronológicas com medições refinadas de anéis de crescimento, pode ser possível calcular as taxas de crescimento e integrar esta informação como variáveis preditoras em modelos de distribuição de espécies, embora necessitem de validação com dados de campo ou de deteção remota. O sinal de temperatura encontrado nas relações de crescimento climático é alarmante, porque espera-se que as temperaturas de verão aumentem (alterações climáticas), o que pode levar à extinção local de espécies. Assim, os métodos utilizados nesta tese sugerem que, esta abordagem pode ser utilizada para compreender o impacto das alterações climáticas no crescimento das árvores. Também, esta abordagem complementada com outras medidas de crescimento radial das árvores e uso de dendrómetros, pode ser aplicada a outras espécies nativas dos Açores em baixa altitude, como Morella faya e Picconia azorica, espécies exóticas, como a Cryptomeria japonica, ou outras espécies já estudadas em climas temperados na Europa. Com a base de dados criada neste trabalho, uma análise global com diferentes métodos de detrending e de abordagens de modelação pode ser aplicada, de forma a dar pistas para uma metodologia abrangente adequada para a região.
- Reconstruction of past environmental changes in the Azores based on lacustrine diatom sedimentary recordsPublication . Marques, Helena Margarida Araújo De Sousa; Gonçalves, Vitor Manuel da Costa; Bao Casal, Roberto; Raposeiro, Pedro Miguel Valente MendesOs ecossistemas lacustres são conhecidos como sentinelas de alterações ambientais. Os impactos naturais e antrópicos a que estes sistemas estão sujeitos ficam arquivados nos seus sedimentos, tanto em elementos bióticos como abióticos, os quais podem ser usados para a reconstrução de ambientes passados em diferentes escalas temporais. AS diatomáceas são consideradas bioindicadores de excelência, e como tal, são usadas com elevada frequência nesses estudos, incluindo reconstruções ambientais para períodos anteriores à existência de dados instrumentais, colmatando a escassez de informação ambiental de longa data, geralmente rara ou em falta na maioria das regiões. Apesar do elevado potencial da paleolimnologia para revela r a história ambiental dos Açores, poucos estudos paleolimnológicos foram realizados no arquipélago, pelo que ainda não são totalmente compreendidos os impactos naturais e humanos que atuam nas lagoas açorianas. A presente tese contribui para o aumento do conhecimento das condições ambientais passadas dos Açores dando resposta às seguintes questões: (1) que tipo de alterações ambientais ocorreu nas lagoas açorianas nos últimos ca. 6000 anos; (2) quando e como foram registados os impactos humanos, vulcânicos e climáticos nos sedimentos lacustres; e (3) quais as condições ambientais de referência para as lagoas antes do impacto humano. Para alcançar estes objetivos procedeu-se à realização de reconstruções ambientais baseadas na análise de diatomáceas nos sedimentos de um conjunto de lagoas açorianas selecionadas para o estudo, composto pela Lagoa Empadadas Norte (Ilha de são Miguel), lagoas Caveiro e Peixinho (Ilha do Pico), lagoas Funda, Rasa e Lomba (Ilha das Flores) e Lagoa do Caldeirão (Ilha do Corvo. AS principais alterações paleolimnológicas detetadas nos últimos ca. 6000 anos incluíram flutuações no nível de água das lagoas, pH e estado trófico, resultantes de impactos naturais e humanos nos ecossistemas. A análise das diatomáceas indicou fases de subidas ou descidas significativas no nível de água das lagoas durante a sua evolução, sugerindo flutuações climáticas relevantes associadas a períodos climáticos mais húmidos […].
- Funcionalização de fibras naturais para aplicações avançadasPublication . Eleutério, Telmo Manuel Ferreira; Vasconcelos, Helena Cristina de Sousa Pereira Menezes; Trota, Maria João Bornes Teixeira Pereira; Fangueiro, Raul Manuel Esteves de SousaEm resultado das atividades antropogénicas, as paisagens açorianas são atualmente dominadas por taxa exóticos. Hedychium gardnerianum Sheph. ex Ker Gawl, foi introduzida na ilha de São Miguel por José do Canto em 1851, como planta ornamental. Esta espécie consta da lista ‘Top 100 of the Worlds Worst Invasive Alien Species’ e nos Açores, é uma das espécies invasoras mais abundantes na maioria dos habitats regionais, constituindo uma ameaça à biodiversidade da região. As várias ações de controlo das espécies invasoras levadas a cabo pelo Governo Regional dos Açores, geram toneladas de resíduos vegetais, cuja recolha e transporte se revela frequentemente difícil e onerosa. Apesar de uma parte dos resíduos verdes ser utilizada na produção de composto, existe uma margem grande para valorizar estes resíduos vegetais, incluindo os resíduos de H. gardnerianum que formam uma grande percentagem desses resíduos vegetais. Recentes inovações, na extração, tratamento e funcionalização de fibras naturais tornaram-nas numa das principais alternativas para a substituição de materiais de origem petroquímica. Nesta perspetiva, este trabalho teve como objetivos calcular a produtividade de H. gardnerianum e valorizar estes resíduos vegetais, através da investigação do seu potencial uso como nova fonte de fibras naturais e da investigação sobre a possibilidade de utilização destas fibras em aplicações avançadas. Para tal, durante 30 meses, foram recolhidos dados e material vegetal num total de 243 m2, distribuídos por três locais a diferentes altitudes na ilha de São Miguel. A partir do material vegetal cortado, foram testados vários métodos de extração das fibras (extração mecânica e macerações química, enzimática ou ao relento) e procedeu-se à sua caracterização física e química, bem como à determinação das suas características, ultraestruturais, mecânicas e térmicas. Finalmente tendo em vista a utilização da fibra de conteira, foram conduzidos estudos de reologia, de formulação de biocompósitos com ácido poliláctico (PLA), e de funcionalização das fibras com filmes SiO₂ e TiO₂. [...].