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- Unveiling the role of methylation prone (MP) and untranslated (UTRs) regions in the clinical variability of Spinocerebellar Ataxia Type 3(SCA3) /Machado-Joseph Disease (MJD): a genome-wide approachPublication . Melo, Ana Rosa Vieira; Lima, Maria Manuela de Medeiros; Bettencourt, Maria da Conceição FélixA Ataxia espinocerebelosa do tipo 3 (SCA3), também conhecida como doença de Machado-Joseph (MJD), é uma doença neurodegenerativa rara de manifestação tardia e pertencente ao grupo das doenças de poliglutamina (poliQ). O gene causal desta doença, ATXN3, apresenta como mutação causal a expansão do motivo repetitivo CAG. Este gene codifica a proteína ATXN3, uma proteína ubíqua que pode estar envolvida nos mecanismos de transcrição. As regiões não traduzidas (UTRs), 5’ e 3’ UTRs, juntamente com elementos cis-acting (tais como os promotores dos genes), são essenciais para a regulação da expressão génica. Além disso, também a metilação do ADN tem um papel importante na referida regulação. O principal objetivo desta tese de doutoramento foi analisar o impacto das regiões não traduzidas e das regiões propensas à metilação, na variabilidade clínica da SCA3. Para este efeito, estudámos a variação encontrada em 3'UTR do gene ATXN3 e analisámos o impacto destas variantes na variação da idade de início da doença nos doentes com SCA3. Reportámos nove variantes presentes em 3'UTR do gene ATXN3 que podem ter um papel na sua própria regulação génica. Na coorte Açoriana, composta por doentes com SCA3, nenhuma das variantes que foram identificadas apresentou um efeito modulador significativo na variação da idade de início da doença, e não fomos capazes de replicar os resultados para a variante rs709930 (e rs910369) obtidos por outro grupo de investigadores. Neste estudo, conseguimos identificar haplótipos associados à doença e que podem fazer a discriminação dos alelos expandidos; este facto pode ser relevante para o desenvolvimento de novas estratégias de allele-specific silencing. Estudámos também a variação encontrada nas UTRs de diferentes genes que foi obtida através da sequenciação alargada do exoma e efetuámos correlações genótipo- fenótipo para avaliar o impacto de tais variantes/genes na variação da idade de início dos doentes com SCA3. Neste estudo identificámos quatro genes candidatos a modificadores da variação da idade de início da doença: GLI4, TGFA, ERBB4 e MPHOSPH9. Os alelos alternativos das variantes no gene GLI4, apresentaram uma modificação prevista nos locais de ligação dos factores de transcrição e nos factores de transcrição, que se ligam a esses locais; este gene apresentou ainda uma variação na idade de início da SCA3 de três anos (a idade de início é mais tardia). Os restantes genes modificadores (TGFA, ERBBB4 e MPHOSPH9) identificados neste estudo, apresentam variantes em 3’UTRs, são conhecidos como interatores do gene ATXN3, e influenciam significativamente a variação na idade de início da doença. Também conseguimos obter oito pathways estatisticamente enriquecidas, duas delas contendo genes com efeito modificador (TGFA e ERBBB4): HIF1α Signaling e Neuregulin Signaling. Estas pathways podem ser importantes para outras aplicações terapêuticas nesta doença. Por fim, efetuámos um estudo piloto de metilação genome-wide. Tanto quanto nos é possível saber, este é o primeiro estudo que investiga as alterações de metilação do ADN em doentes com SCA3 e em controlos emparelhados. Como o tamanho da amostra foi pequeno, não esperávamos a ocorrência de CpGs diferencialmente metiladas, entre doentes e controlos. A análise de enriquecimento da lista de 1279 genes que obtivemos, mostrou um enriquecimento para pathways envolvidas em doenças neurodegenerativas, tais como a Calcium signaling pathway. Também realizámos uma análise com epigenetic clocks (Hannum e Horvath) para doentes com SCA3 e controlos emparelhados. Não conseguimos encontrar diferenças entre doentes e controlos para a idade de metilação do ADN, para ambos epigenetic clocks . No caso da diferença da idade de metilação do ADN e a diferença da idade de metilação residual do ADN, também não fomos capazes de encontrar diferenças entre os dois grupos para ambos os epigenetic clocks. Estes resultados podem ser explicados pelo tamanho da amostra e pelo poder limitado deste estudo. Esta tese de doutoramento tentou contribuir para a descoberta do papel das regiões não traduzidas e às regiões propensas à metilação na variabilidade clínica da SCA3. Para este efeito, obtivemos: a) variantes com impacto previsto em 3'UTR do gene ATXN3; b) genes candidatos a modificadores, com variantes em UTRs; c) nenhum resultado significativo para o primeiro estudo a nível do genoma sobre a metilação do ADN, comparando doentes e controlos; serão necessários mais estudos, num número maior de doentes e controlos para obter um perfil de metilação para a SCA3.