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- Exploração dos recursos genéticos dos Açores para o desenvolvimento de uma enzima com aplicações na saúde: desenvolvimento de uma abordagem direcionada baseada em nanotecnologia (Enzyme4Thrombus)Publication . Lopes, Ivo Edgar Araújo; Simões, Nelson José de Oliveira; Gomes, Andreia Ferreira CastroAs doenças cardiovasculares, como a trombose, são a primeira causa de morte a nível mundial, sendo que a trombose resulta da ativação descontrolada da cascata fibrinolítica. Os agentes mais eficazes para o tratamento de doenças trombóticas são as enzimas fibrinolíticas. Neste âmbito, a enzima AprE127, produzida por um Bacillus subtilis isolado de amostras de solo da ilha de São Miguel, demonstrou ter atividade fibrinolítica específica, sem atuar como ativador do plasminogénio, possibilitando uma dissolução rápida e completa de trombos sanguíneos. Assim, o presente estudo teve como objetivo obter a enzima fibrinolítica AprE127 por expressão heteróloga, para possibilitar a sua produção em larga escala, e desenvolver uma nanoformulação baseada em lipossomas, para melhorar a entrega da enzima no organismo, reduzindo a possibilidade de reações imunológicas e de efeitos secundários. Para tal, desenvolveram-se, por tecnologia de DNA recombinante, duas versões da AprE127: a proteína AprE127 madura e a AprE127 sob a forma de pró-proteína. A expressão de ambas as versões da AprE127 foi testada em múltiplos vetores de expressão citoplasmática em E. coli, e em quatro linhagens celulares distintas (BL21, C41, Rosetta II e MC1061). Os resultados mostram que a proteína AprE127 madura foi expressa sob a forma insolúvel, em corpos de inclusão, mesmo no clone em que foi expressa em fusão com a enzima glutationa S-transferase (no vetor pGEX-4T-1), que não promoveu a solubilidade da AprE127. Apesar da proteína ter sido produzida em corpos inclusão, foram também obtidos bons rendimentos de produção médios de expressão (4 mg de proteína por litro de cultura) nos vetores pET23a(+) e pHTP1 (com otimização de codões para E. coli no caso do último vetor). De forma a obter a configuração funcional da proteína, esta foi desnaturada e renaturada a diferentes pHs, ambientes redox e força iónica, e com diferentes cofatores. Após os ensaios de desnaturação e renaturação da proteína madura, verificou-se que esta não adquiriu a conformação tridimensional correta, que lhe conferisse o nível de atividade proteolítica da proteína AprE127 nativa. Por outro lado, a proteína AprE127 foi obtida na forma solúvel, quando expressa sob a forma de pró-proteína, em fusão com as proteínas MBP ou SUMO. Não obstante, a expressão da pró-proteína solúvel apresentou um rendimento de produção médio mais baixo (1 mg de proteína por litro de cultura), e agravado pela necessidade de clivagem da proteína de fusão a jusante. A expressão heteróloga de ambas as versões da proteína AprE12 foi confirmada por Western-Blot e por espectrometria de massa. A proteína AprE127 madura foi incorporada na formulação patenteada de lipossomas DODAB/MO 1:2 (mol/mol), aproveitando as caraterísticas estruturais singulares do lípido monooleina, que potenciam a solubilização de proteínas. Estes lipossomas apresentaram características físico-químicas favoráveis à sua aplicação na entrega de fármacos, tendo tamanhos abaixo dos 200 nm e carga superficial positiva (entre os 40 e 60 mV). Estudou-se ainda a citotoxicidade dos lipossomas contendo a proteína recombinante madura, que demonstraram citotoxicidade dependente de dose. Desenvolveram-se adicionalmente lipossomas miméticos de exossomas, inovadores por mimetizarem a composição lipídica destas vesículas naturais, e que retêm algumas das suas caraterísticas desejáveis para aplicação na entrega controlada de biomoléculas, permitindo elevadas eficiências de encapsulamento e produção em larga escala, que o uso dos próprios exossomas não possibilita. Estes lipossomas apresentaram características físico-químicas favoráveis à sua aplicação por injeção intravenosa (tamanhos inferiores a 150 nm e carga superficial neutra), tendo também demostrado ser estáveis em condições fisiológicas, uma vez que não se verificaram alterações substanciais no tamanho, PDI e carga superficial após incubação em plasma humano. Este trabalho representou um primeiro passo para o desenvolvimento de uma tecnologia inovadora para o tratamento da trombose, recorrendo a um recurso natural dos Açores, i.e. a proteína AprE127, cujo potencial se encontrava ainda largamente inexplorado devido à sua baixa biodisponibilidade. Neste contexto, o recurso aos lipossomas nanométricos para encapsular a AprE127, permite potenciar a sua aplicação para a degradação de trombos sanguíneos.