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Estudo de uma proteína Cry com actividade nematicida e obtenção da sequência genética codificante
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
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| Resumo, Índice, Introdução | 835.96 KB | Adobe PDF | ||
| Documento Principal | 1.76 MB | Adobe PDF |
Authors
Abstract(s)
É vital a pesquisa de novas toxinas com actividade nematicida, uma vez que os nematodes estão associados a uma vasta gama de problemas de saúde nos humanos e a presença de populações resistentes tem vindo a aumentar. Um estudo prévio revelou que um isolado de Bacillus thuringiensis do banco de entomopatógenos da Universidade dos Açores tinha a presença de uma sequência parcial de um gene com homologia com genes codificantes de uma família de proteínas de inclusão cristalina parasporal (Cry) com actividade nematicida. Este trabalho teve como objectivo averiguar a presença desta proteína, proceder a uma caracterização parcial e determinar a sua actividade nematicida. Teve por objectivo também a determinação da sua sequência genética codificante, utilizando a sequência parcial conhecida como base para uma abordagem de chromosome walking. Os cristais proteicos produzidos pelo isolado foram recolhidos, solubilizados, separados por SDS-PAGE, fraccionados por FPLC de exclusão molecular e a actividade nematicida de todas estas formas da proteína foram testadas. Para o chromosome walking procedeuse a 3 ciclos de SON-PCR (Single Oligonucleotide Nested PCR), clonagem em TOPOTA, transformação em E. coli e sequenciação Sanger dos fragmentos clonados. Os resultados mostraram que a proteína Cry, tanto na sua forma de protoxina cristalina de 140kDa de peso molecular como na sua forma solúvel de ~70kDa apresentava toxicidade de forma dose-dependente, com mortalidades médias em C. elegans acima dos 90% nas doses superiores a 6,1μg de proteína solúvel. A sequência genética codificante obtida (4550bp) mostrou homologias na ordem dos 70% com sequências codificantes de outras toxinas de Bacillus thuringiensis, e a sequência de aminoácidos da proteína predita revelou baixas homologias (<45%) com outras proteínas Cry nematicidas (Cry21Ba1) e a presença de um domínio conservado relativo à família das toxinas Cry. Os resultados dos testes nematicidas apontam para o isolado em estudo como fonte de um eficaz agente nematicida, tanto na forma cristalina como solúvel da toxina. Relativamente à sequência codificante obtida, a homologia da sequência da proteína predita é baixa o suficiente para constituir um novo primeiro rank de nomenclatura de proteínas Cry, segundo o Bacillus thuringiensis delta-endotoxin nomenclature committee. Em suma, os resultados da toxicidade associados às baixas homologias encontrada para proteína predita apontam para que a proteína em estudo represente uma possível nova família de toxinas Cry com elevada toxicidade contra nematodes.
ABSTRACT: Because nematodes are associated with a vast range of health problems in humans, and since there has been a rise in resistant populations, the search for new nematicidal toxins is of vital importance. A previous study showed a nematicidal parasporal crystalline inclusion protein (Cry) sequence homology with a partial genetic sequence from a Bacillus thuringiensis isolate from the Azorean entomopathogenic collection of the Universidade dos Açores. This study intended to ascertain the presence of this protein in the isolate, partially characterize it and determine its nematicidal activity. It also intended to determine the protein’s coding sequence, by using the known partial sequence as the base for a chromosome walking approach. The crystalline proteins produced by the isolate were collected, solubilized, separated by SDS-PAGE, fractioned by size-exclusion FPLC, and its nematicidal activity determined in all the above forms. For the chromosome walking approach, 3 SON-PCR (Single Oligonucleotide Nested PCR) cycles were run, followed by TOPO-TA cloning, E. coli transformation and Sanger sequencing of the cloned fragments. Results showed that in both its ~140kDa molecular weight crystalline protoxin and ~70kDa soluble form, the protein showed dose-dependent toxicity in C. elegans, with over 90% average mortality rates on soluble protein doses greater than 6,1μg. The protein coding sequence obtained (4550bp) showed ~70% homologies with known Bacillus thuringiensis toxins, while the predicted protein amino acid sequence showed low homologies (<45%) with other known nematicidal proteins (Cry21Ba1), as well as showing the presence of a Cry toxin putative conserved domain. The nematicidal assays demonstrate that the Cry protein produced in question constitutes a powerful nematicidal agent, both in its crystalline and soluble form. Regarding the coding sequence obtained, predicted protein homologies are low enough to establish a new first rank of Cry protein nomenclature, according to the Bacillus thuringiensis delta-endotoxin nomenclature committee. In summary, considering the assayed protein toxicity and low predicted protein homologies, this protein may in fact represent a novel high nematicidal activity Cry protein family.
ABSTRACT: Because nematodes are associated with a vast range of health problems in humans, and since there has been a rise in resistant populations, the search for new nematicidal toxins is of vital importance. A previous study showed a nematicidal parasporal crystalline inclusion protein (Cry) sequence homology with a partial genetic sequence from a Bacillus thuringiensis isolate from the Azorean entomopathogenic collection of the Universidade dos Açores. This study intended to ascertain the presence of this protein in the isolate, partially characterize it and determine its nematicidal activity. It also intended to determine the protein’s coding sequence, by using the known partial sequence as the base for a chromosome walking approach. The crystalline proteins produced by the isolate were collected, solubilized, separated by SDS-PAGE, fractioned by size-exclusion FPLC, and its nematicidal activity determined in all the above forms. For the chromosome walking approach, 3 SON-PCR (Single Oligonucleotide Nested PCR) cycles were run, followed by TOPO-TA cloning, E. coli transformation and Sanger sequencing of the cloned fragments. Results showed that in both its ~140kDa molecular weight crystalline protoxin and ~70kDa soluble form, the protein showed dose-dependent toxicity in C. elegans, with over 90% average mortality rates on soluble protein doses greater than 6,1μg. The protein coding sequence obtained (4550bp) showed ~70% homologies with known Bacillus thuringiensis toxins, while the predicted protein amino acid sequence showed low homologies (<45%) with other known nematicidal proteins (Cry21Ba1), as well as showing the presence of a Cry toxin putative conserved domain. The nematicidal assays demonstrate that the Cry protein produced in question constitutes a powerful nematicidal agent, both in its crystalline and soluble form. Regarding the coding sequence obtained, predicted protein homologies are low enough to establish a new first rank of Cry protein nomenclature, according to the Bacillus thuringiensis delta-endotoxin nomenclature committee. In summary, considering the assayed protein toxicity and low predicted protein homologies, this protein may in fact represent a novel high nematicidal activity Cry protein family.
Description
Dissertação de Mestrado, Ciências Biomédicas, 24 de outubro de 2018, Universidade dos Açores.
Keywords
Bacillus thuringiensis Genética Nemátodes Nematicida Proteína Cry
Pedagogical Context
Citation
Sousa, Pedro Miguel Cordeiro. "Estudo de uma proteína Cry com actividade nematicida e obtenção da sequência genética codificante". 2018. 63 p.. (Dissertação de Mestrado em Ciências Biomédicas). Ponta Delgada: Universidade dos Açores, 2018. [Consult. Dia Mês Ano]. Disponível em www:<http://hdl.handle.net/10400.3/5027>.