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- Estudo de uma proteína Cry com actividade nematicida e obtenção da sequência genética codificantePublication . Sousa, Pedro Miguel Cordeiro; Cabral, Carla Manuela Machado Mendes Leite; Tiago, Duarte Nuno ToubarroÉ vital a pesquisa de novas toxinas com actividade nematicida, uma vez que os nematodes estão associados a uma vasta gama de problemas de saúde nos humanos e a presença de populações resistentes tem vindo a aumentar. Um estudo prévio revelou que um isolado de Bacillus thuringiensis do banco de entomopatógenos da Universidade dos Açores tinha a presença de uma sequência parcial de um gene com homologia com genes codificantes de uma família de proteínas de inclusão cristalina parasporal (Cry) com actividade nematicida. Este trabalho teve como objectivo averiguar a presença desta proteína, proceder a uma caracterização parcial e determinar a sua actividade nematicida. Teve por objectivo também a determinação da sua sequência genética codificante, utilizando a sequência parcial conhecida como base para uma abordagem de chromosome walking. Os cristais proteicos produzidos pelo isolado foram recolhidos, solubilizados, separados por SDS-PAGE, fraccionados por FPLC de exclusão molecular e a actividade nematicida de todas estas formas da proteína foram testadas. Para o chromosome walking procedeuse a 3 ciclos de SON-PCR (Single Oligonucleotide Nested PCR), clonagem em TOPOTA, transformação em E. coli e sequenciação Sanger dos fragmentos clonados. Os resultados mostraram que a proteína Cry, tanto na sua forma de protoxina cristalina de 140kDa de peso molecular como na sua forma solúvel de ~70kDa apresentava toxicidade de forma dose-dependente, com mortalidades médias em C. elegans acima dos 90% nas doses superiores a 6,1μg de proteína solúvel. A sequência genética codificante obtida (4550bp) mostrou homologias na ordem dos 70% com sequências codificantes de outras toxinas de Bacillus thuringiensis, e a sequência de aminoácidos da proteína predita revelou baixas homologias (<45%) com outras proteínas Cry nematicidas (Cry21Ba1) e a presença de um domínio conservado relativo à família das toxinas Cry. Os resultados dos testes nematicidas apontam para o isolado em estudo como fonte de um eficaz agente nematicida, tanto na forma cristalina como solúvel da toxina. Relativamente à sequência codificante obtida, a homologia da sequência da proteína predita é baixa o suficiente para constituir um novo primeiro rank de nomenclatura de proteínas Cry, segundo o Bacillus thuringiensis delta-endotoxin nomenclature committee. Em suma, os resultados da toxicidade associados às baixas homologias encontrada para proteína predita apontam para que a proteína em estudo represente uma possível nova família de toxinas Cry com elevada toxicidade contra nematodes.