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- Modificadores genéticos da instabilidade da repetição (CAG)n na doença de Machado-Joseph/Ataxia Espinocerebelosa do Tipo 3Publication . Pavão, Sara Raquel Rebelo; Lima, Maria Manuela de Medeiros; Raposo, Mafalda Sofia BastosA doença de Machado-Joseph (DMJ), também conhecida por ataxia espinocerebelosa do tipo 3 (SCA3), é uma doença autossómica dominante causada pela expansão de motivos repetitivos CAG no exão 10 do gene ATXN3, localizado em 14q32.1. O tamanho das repetições é o principal condicionante da idade de manifestação e severidade da doença. Os alelos normais têm um comportamento estável, mantendo-se inalterado o número de repetições aquando da mitose e da meiose. Todavia, na DMJ, à semelhança do que acontece noutras doenças de poliglutamina (poliQ), os alelos expandidos apresentam instabilidade somática e intergeracional. O papel dos mecanismos de reparação do DNA na instabilidade das repetições permanece por esclarecer. Os principais objectivos da presente dissertação foram: (1) caracterizar a instabilidade somática e intergeracional em sujeitos DMJ açorianos; (2) analisar a associação entre as variantes PMS2 g.26796 C>A (rs1805323), ERCC6 g.19868 G>A (rs2228528) e FAN1 g.3228531 C>G (rs3512) e a instabilidade somática e intergeracional; (3) analisar a associação entre as variantes referidas em (2) e a idade de início da DMJ. No presente estudo foram utilizadas amostras de DNA de 54 sujeitos DMJ. Para o estudo da instabilidade intergeracional usaram-se 50 amostras de DNA de sangue (num total de 31 transmissões). Para o estudo do mosaicismo somático utilizaram-se 26 amostras de DNA de sangue e 26 amostras de DNA de mucosa bucal, representando 26 indivíduos. A determinação das repetições CAG no alelo expandido do gene ATXN3 foi efectuada utilizando PCR convencional e TP-PCR (Triplet repeat primed PCR), seguidas de análise de fragmentos por electroforese capilar. As amostras foram genotipadas para as variantes alélicas dos genes PMS2, ERCC6 e FAN1 por sequenciação de Sanger. Para a análise da instabilidade somática, após o cálculo dos genótipos obtidos por AF, foi calculada a diferença entre o tamanho da repetição CAG obtido a partir do DNA extraído das 26 amostras de sangue e do DNA extraído de mucosa bucal, para cada indivíduo (CAGexp (sangue) – CAGexp (mucosa bucal)). A partir da análise do padrão de picos obtido na TP-PCR, determinou-se o índice de mosaicismo (IM). O genótipo obtido por PCR convencional foi utilizado para classificar as transmissões em estáveis e instáveis, calculando-se a diferença no número de repetições CAG entre o descendente e o progenitor (CAGexp (descendente) – CAGexp (progenitor)). A presença/ausência de instabilidade somática e intergeracional foi correlacionada com as variantes alélicas ERCC6 g.19868 G>A, FAN1 g.3228531 C>G e PMS2 g.2696 C>A. Cinquenta por cento dos indivíduos não apresentam mosaicismo somático nos 2 tecidos estudados. O valor médio de IM para cada um dos tecidos foi semelhante, apesar de ligeiramente superior no sangue, indicando uma maior instabilidade neste tecido relativamente ao epitélio da mucosa bucal. Das transmissões estudadas, 70% foram instáveis e 30% estáveis, sendo que nas instáveis 66,7% corresponderam a expansões e 33,8% a contracções. Não foi observada nenhuma associação entre as variantes ERCC6 g.19868 G>A e FAN1 g.3228531 C>G e a instabilidade somática e intergeracional. De acordo com a correlação genótipo-fenótipo efectuada entre o gene FAN1 e a idade de início da DMJ observou-se que os doentes FAN1*GG apresenta uma idade significativamente mais tardia que os doentes FAN1*CC. Este resultado está de acordo com o previamente reportado numa série extensa de doentes com várias doenças de poliQ. A confirmação do papel do FAN1 na patogénese da DMJ permitirá compreender a interligação da via de reparação de Fanconi Anemia, na qual o gene FAN1 está envolvido, e a patogénese molecular da DMJ, assim evidenciando um potencial papel desta via enquanto alvo terapêutico.