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- Predicting and tracking Machado-Joseph disease : biomarkers of diagnosis and prognosisPublication . Raposo, Mafalda Sofia Bastos; Lima, Maria Manuela de Medeiros; Bettencourt, Maria da Conceição FélixA doença de Machado-Joseph/ataxia espinocerebelosa do tipo 3 (DMJ/SCA3) é uma doença neurodegenerativa rara e de início tardio, que permanece sem tratamento. À semelhança do que acontece nas restantes doenças de poliglutamina (poliQ), a mutação na base da DMJ corresponde à expansão de um motivo CAG na região codificante do respetivo gene causal, ATXN3. Sendo uma doença progressiva, a DMJ é caracterizada por várias fases, ao longo da sua progressão, nomeadamente por um longo período préclínico; durante esse período deverão ocorrer alterações moleculares e até mesmo clínicas, as quais podem surgir muitos anos antes da ataxia. A idade de inicio da ataxia, usualmente o primeiro sintoma da doença, é maioritariamente explicada pelo tamanho do tracto CAG que constitui assim o principal biomarcador de diagnóstico molecular da DMJ. Genes modificadores deverão, adicionalmente, contribuir para a explicação da idade de início da doença; tais modificadores genéticos, podem também ser considerados biomarcadores de diagnóstico da DMJ. A identificação deste tipo de biomarcadores permitirá: (1) melhorar a previsão da idade de início da doença e (2) aumentar o poder estatístico em ensaios clínicos, permitindo a estratificação dos doentes usando informação proveniente dos modificadores genéticos. As diferentes fases da DMJ são atualmente caracterizadas recorrendo à utilização de informação clínica (principalmente de escalas clínicas) ou de dados obtidos a partir de estudos de imagem, sendo o conhecimento acerca das alterações moleculares que deverão ocorrer ao longo da doença muito incipiente, o que se reflete na ausência de biomarcadores de monitorização da doença. A identificação deste tipo de biomarcadores permitirá: (1) a previsão da idade de início patológica (idade à qual alterações ao nível celular já estão presentes, mas o doente ainda não apresenta sintomas), (2) a monitorização das diferentes fases da progressão da doença e (3) a detecção de benefícios terapêuticos subtis, em futuros ensaios clínicos. O objetivo principal desta dissertação foi contribuir para o desenvolvimento de biomarcadores moleculares da DMJ. RNA e DNA, obtidos a partir de amostras de sangue de indivíduos pré-clínicos (portadores da mutação ATXN3, mas sem sintomatologia) e doentes DMJ de origem açoriana, incluindo amostras colhidas em dois momentos diferentes, constituíram o principal recurso para o desenvolvimento deste projeto de doutoramento. Foram também utilizadas amostras de indivíduos saudáveis da mesma população, que foram usados como controlo. O número de repetições CAG no gene ATXN3 foi determinado para todos os indivíduos DMJ. A coorte DMJ açoriana, constituída por um total de 88 doentes, foi caracterizada. Para 69 dos doentes avaliados, utilizando a escala clinica NESSCA (Neurological Examination Score for Spinocerebellar Ataxia), a média da pontuação foi de 12 ± 5 (média ± desvio padrão); 40% da variância desta pontuação é explicada pelo número de repetições CAG no alelo expandido e pela duração da doença. As alterações oculares, nomeadamente a presença de nistagmo, fazem parte do conjunto de características clínicas habitualmente descritas na DMJ. A avaliação do nistagmo em fases iniciais da doença, nomeadamente na fase pré-clínica, foi realizada em portadores assintomáticos e não-portadores da mutação ATXN3. A frequência do nistagmo em portadores assintomáticos (17%) e sua ausência em não-portadores da mutação sugere que o nistagmo pode preceder a ataxia e, portanto, ser considerado um sinal precoce da DMJ. Nesta dissertação, foi utilizada uma abordagem de genes candidatos para identificar modificadores da idade de início da DMJ. O número de repetições CAG em loci de doenças polyQ, nomeadamente as ataxias espinocerebelosas (SCA) dos tipos 1, 2, 6, 7, 17, a doença de Huntington (HD) e a atrofia dentato-rubro-pálido-luisiana (DRPLA) foi investigado como potencial modificador da idade de início em doentes açorianos; observou-se uma correlação negativa entre o alelo normal maior no gene ATXN1 e a idade de início da doença, sendo que a presença deste alelo aumentou significativamente em 1,5% a explicação da variância da idade de início. Adicionalmente, e por ter sido descrito na DMJ um papel da inflamação, foram estudadas, como modificadores da idade de inicio, variantes alélicas na região promotora de genes de citocinas, uma vez que estas variações podem alterar os seus níveis de expressão. Os doentes que possuíam o alelo IL6*C apresentaram uma idade de início significativamente mais precoce. Um conjunto complexo de mecanismos, que inclui a regulação da transcrição, o sistema ubiquitina-proteassoma, a autofagia, a apoptose e a função mitocondrial, tem sido implicado na patogénese da DMJ. Os resultados de uma análise de expressão wholegenome, seguida de vários passos de validação, mostraram que mesmo num tecido periférico, a desregulação da transcrição estava alterada e que os genes FCGR3B, P2RY13 e SELPLG estavam desregulados em doentes. Utilizando a desregulação dos níveis de mRNA como argumento para identificar novos candidatos a biomarcadores, foram analisados os padrões de expressão de nove genes - HSPB1, DNAJB1, DNAJB12, DNAJB14, BAX, BCL2, SOD2, IL1B e IL6. Observou-se que em indivíduos pré-clínicos os níveis de mRNA dos genes IL6 e BCL2 eram mais baixos relativamente aos controlos. Em indivíduos já com sintomatologia, foram observados níveis mais baixos de mRNA dos genes HSPB1 e BCL2, comparativamente aos controlos. No estudo exploratório longitudinal foi observada uma diminuição significativa dos níveis de mRNA do gene BCL2 durante a progressão da doença. Resultados inconsistentes sobre o dano e a deplecção do DNA mitocondrial (mtDNA) em doentes DMJ têm sido reportados. Neste trabalho, verificou-se que os doentes e os portadores pré-clínicos apresentavam mais deleções do mtDNA (common deletion) do que os controlos. Embora as características clinicas e fisiológicas inerentes à DMJ reflitam principalmente alterações do processo neurodegenerativo, alterações moleculares quantificadas em sangue foram descritas nesta dissertação. A confirmação de uma relação entre as alterações periféricas e a neurodegeneração constitui uma nova oportunidade para o desenvolvimento de biomarcadores. Passos adicionais de validação serão cruciais para desenvolver um conjunto de biomarcadores moleculares capazes de monitorizar a progressão da doença, bem como de detectar alterações terapêuticas subtis em futuros ensaios clínicos, incluindo ensaios preventivos. Os biomarcadores moleculares devem também ser capazes de se correlacionar com marcadores clínicos e de imagiologia. Todos os esforços serão realizados no sentido de testar os biomarcadores moleculares aqui propostos em coortes independentes, bem como de investigar o seu potencial em estudos longitudinais.