Percorrer por autor "Pacheco, Sabrina da Silva"
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- Pesquisa de péptidos antimicrobianos em isolados Açorianos de Bacillus com ação contra StaphylococcusPublication . Pacheco, Sabrina da Silva; Cabral, Carla Manuela Machado Mendes Leite; Tiago, Duarte Nuno Toubarro; Simões, Nelson José de OliveiraAs bactérias produzem péptidos antimicrobianos que apresentam atividade sobre vários organismos, incluindo bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. As bacteriocinas são péptidos antimicrobianos de baixo peso molecular sintetizados por via ribossómica, apresentando diversas aplicações, como a produção de novos fármacos. Algumas bacteriocinas produzidas por Bacillus demonstram atividade contra patógenos multirresistentes, como é o caso do Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA). Este trabalho teve como objetivo a identificação de compostos antimicrobianos produzidos a partir de Bacillus isolados do solo dos Açores com ação contra Staphylococcus. De 20 isolados iniciais, pelo método de co-inoculação com M. luteus, S. aureus e E. coli, foram escolhidos 7 isolados que apresentavam elevada atividade antimicrobiana. Procedeu-se à cultura em meio líquido destes 7 isolados, selecionando dois (S117B e S118E) que apresentavam atividade apenas sobre M. luteus. Otimizou-se a produção de AMP’s em meio líquido através da imobilização das células produtoras em esferas de agar. Deste processo resultou a recuperação da atividade contra S. aureus, e o aumento de atividade antimicrobiana, contra M. luteus, que tinha sido perdida quando as células foram transferidas do crescimento em meio sólido para o meio líquido. Foi selecionado o isolado S118E por apresentar mais atividade antimicrobiana, especialmente, contra S. aureus. Utilizando a mesma técnica de imobilização, aumentou-se a produção de sobrenadante. Através da degradação com 5mg/mL de proteinase K e da inativação pelo aumento da temperatura, concluiu-se que o composto ativo apresentava natureza proteica. Baseados nesta informação orientámos o processo de separação para pequenas moléculas de natureza proteica. O sobrenadante das culturas foi recolhido, filtrado e testado em todas as etapas, inicialmente, pelo método de difusão em agar e, posteriormente, substituído pelo método de diluição em meio líquido. O sobrenadante foi concentrado e fracionado tanto por Centricon, como por processos de precipitação, utilizando sais e solventes orgânicos. O sobrenadante do processo de precipitação com acetona otimizado foi fracionado através da coluna Superdex peptide 10/300 GL, coluna de fase reversa com resina C18 e coluna de fase reversa RPC por FPLC. A atividade foi recolhida da coluna Superdex entre os 21 e 22 minutos, indicando para moléculas menores que 5kDa. A atividade antimicrobiana foi, também, eluída com 30% e 60% de acetona na coluna C18 e eluída por volta dos 60% de acetona da coluna RPC. Foi atingida a maior purificação com 220 fold de purificação e 20% de recuperação na amostra 60% C18. Verificou-se que a atividade não era detetável à absorvância de 280nm. Ambas as frações analisadas por MALDI-TOF MS estão enriquecidas em péptidos com peso molecular entre 700 e 1024 Da. A análise do gene 16S identificou o isolado S118E como Bacillus pumilus, posteriormente, confirmado pela análise do genoma com 3,6Mbp. Da mineração genómica resultaram 4 clusters de genes com 78%, 80%, 85% e 91% de similaridade com cluster produtores de lichenisina, bacilibactina, bacilisina e plantazolicina, respetivamente. Confirmou-se a presença do gene pznA que sintetiza para o péptido precursor da plantazolicina e para o gene pznC que sintetiza enzimas modificadoras deste péptido. Este trabalho permitiu identificar bacteriocinas produzidas por Bacillus pumilus S118E com ação contra Staphylococcus aureus sendo necessário mais testes para confirmar a sua atividade anti-MRSA.