Browsing by Author "Borges, Margarida Botelho"
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- Caracterização de enzimas do veneno de Physalia physalis: estudo bioquímico e ação na coagulação ex vivoPublication . Borges, Margarida Botelho; Toubarro, Duarte Nuno; Oliveira, Nelson José de; Mendonça, Duarte Manuel da SilvaA Physalia physalis, comumente conhecida como Caravela Portuguesa, é um hidrozoário colonial flutuante encontrado em ampla distribuição pelo Oceano Atlântico. A sua ocorrência é frequentemente observada no arquipélago dos Açores, ocorrendo sazonalmente em grandes aglomerados de maio a agosto. O contato com suas células urticantes resulta no envenenamento agudo que pode provocar inflamação e perturbações na hemostasia, afetando a agregação plaquetária e a coagulação. Embora em outras águas-vivas esses sintomas tenham sido associados à presença de enzimas proteolíticas, pouco se sabe sobre o veneno da P. physalis. Este estudo tem como objetivo analisar a ação do veneno da P. physalis na hemostasia, centrando-se na investigação das enzimas presentes no veneno e o seu mecanismo de ação sobre a coagulação. O veneno da P. physalis foi obtido por meio de cinco métodos distintos. A extração através da homogeneização dos tentáculos com “ultraturrax” (Vh) e a indução das células urticantes (nematocistos) por electroestimulação (VT), foram os métodos que resultaram num extrato de veneno com maior atividade enzimática. Os venenos obtidos por esses dois métodos apresentaram diferentes padrões proteicos, pelo que foram ambos utilizados no estudo das enzimas e suas ações na coagulação. A análise com substratos e inibidores específicos revelou pela primeira vez que o veneno de P. physalis exibe atividade proteolítica, do tipo serino protéase, especificamente quimotripsina, e serino metaloproteases. O veneno obtido pelos métodos Vh e VT exibiu atividades distintas sobre o fibrinogénio e o coágulo de fibrina, com impacto reduzido na cascata de coagulação. O veneno obtido por indução dos nematocistos (VT) demonstrou elevada eficiência na digestão do coágulo de fibrina, apresentando simultaneamente atividade fibrinolítica e fibrinogenolítica. Por outro lado, o veneno obtido por homogeneização dos tentáculos (Vh) não apresentou atividade fibrinolítica, mas exibiu uma hidrólise altamente específica do fibrinogénio, gerando péptidos de fibrina com aproximadamente 23 kDa, semelhantes aos formados pela ação da trombina. Estes péptidos de fibrina demonstraram a capacidade de formar um coágulo instantâneo, sugerindo um efeito pró-coagulante. A atividade pró-coagulante da amostra Vh e a ação trombolítica da amostra VT foram confirmadas nos ensaios de lise do coágulo de euglobulina em plasma humano. Nenhuma das amostras testadas apresentou atividade hemolítica. O fracionamento da amostra Vh, por FPLC, resultou em quatro frações com padrões proteicos e enzimáticos distintos. Duas dessas frações (#2 e #3) apresentaram ação pró-coagulante, enquanto as outras duas frações (#1 e #4) apresentaram ação fibrinogenolítica e trombolítica. A caracterização da atividade enzimática das frações obtidas por cromatografia permitiu determinar que a atividade trombolítica é promovida por metaloproteases, enquanto o efeito pró-coagulante é mediado por serino protéases. Este estudo permitiu identificar, pela primeira vez, proteínas do veneno que podem estar envolvidas nos distúrbios hemostáticos resultantes do envenenamento agudo por P. physalis e que por este motivo podem constituir importantes fatores de toxicidade. O seu estudo pode contribuir para o desenvolvimento futuro de antídotos ou para o desenvolvimento de novas moléculas para terapias anti trombóticas.