Cabral, Carla Manuela Machado Mendes LeiteTiago, Duarte Nuno ToubarroSimões, Nelson José de OliveiraPacheco, Sabrina da Silva2025-11-252025-11-252024-04-05PACHECO, Sabrina da Silva. (2024). "Pesquisa de péptidos antimicrobianos em isolados Açorianos de Bacillus com ação contra Staphylococcus". Ponta Delgada: Universidade dos Açores, 71 p. Dissertação de Mestrado em Ciências Biomédicas. Disponível em http://hdl.handle.net/10400.3/8741http://hdl.handle.net/10400.3/8741Dissertação de Mestrado, Ciências Biomédicas, 05 de abril de 2024, Universidade dos Açores.As bactérias produzem péptidos antimicrobianos que apresentam atividade sobre vários organismos, incluindo bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. As bacteriocinas são péptidos antimicrobianos de baixo peso molecular sintetizados por via ribossómica, apresentando diversas aplicações, como a produção de novos fármacos. Algumas bacteriocinas produzidas por Bacillus demonstram atividade contra patógenos multirresistentes, como é o caso do Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA). Este trabalho teve como objetivo a identificação de compostos antimicrobianos produzidos a partir de Bacillus isolados do solo dos Açores com ação contra Staphylococcus. De 20 isolados iniciais, pelo método de co-inoculação com M. luteus, S. aureus e E. coli, foram escolhidos 7 isolados que apresentavam elevada atividade antimicrobiana. Procedeu-se à cultura em meio líquido destes 7 isolados, selecionando dois (S117B e S118E) que apresentavam atividade apenas sobre M. luteus. Otimizou-se a produção de AMP’s em meio líquido através da imobilização das células produtoras em esferas de agar. Deste processo resultou a recuperação da atividade contra S. aureus, e o aumento de atividade antimicrobiana, contra M. luteus, que tinha sido perdida quando as células foram transferidas do crescimento em meio sólido para o meio líquido. Foi selecionado o isolado S118E por apresentar mais atividade antimicrobiana, especialmente, contra S. aureus. Utilizando a mesma técnica de imobilização, aumentou-se a produção de sobrenadante. Através da degradação com 5mg/mL de proteinase K e da inativação pelo aumento da temperatura, concluiu-se que o composto ativo apresentava natureza proteica. Baseados nesta informação orientámos o processo de separação para pequenas moléculas de natureza proteica. O sobrenadante das culturas foi recolhido, filtrado e testado em todas as etapas, inicialmente, pelo método de difusão em agar e, posteriormente, substituído pelo método de diluição em meio líquido. O sobrenadante foi concentrado e fracionado tanto por Centricon, como por processos de precipitação, utilizando sais e solventes orgânicos. O sobrenadante do processo de precipitação com acetona otimizado foi fracionado através da coluna Superdex peptide 10/300 GL, coluna de fase reversa com resina C18 e coluna de fase reversa RPC por FPLC. A atividade foi recolhida da coluna Superdex entre os 21 e 22 minutos, indicando para moléculas menores que 5kDa. A atividade antimicrobiana foi, também, eluída com 30% e 60% de acetona na coluna C18 e eluída por volta dos 60% de acetona da coluna RPC. Foi atingida a maior purificação com 220 fold de purificação e 20% de recuperação na amostra 60% C18. Verificou-se que a atividade não era detetável à absorvância de 280nm. Ambas as frações analisadas por MALDI-TOF MS estão enriquecidas em péptidos com peso molecular entre 700 e 1024 Da. A análise do gene 16S identificou o isolado S118E como Bacillus pumilus, posteriormente, confirmado pela análise do genoma com 3,6Mbp. Da mineração genómica resultaram 4 clusters de genes com 78%, 80%, 85% e 91% de similaridade com cluster produtores de lichenisina, bacilibactina, bacilisina e plantazolicina, respetivamente. Confirmou-se a presença do gene pznA que sintetiza para o péptido precursor da plantazolicina e para o gene pznC que sintetiza enzimas modificadoras deste péptido. Este trabalho permitiu identificar bacteriocinas produzidas por Bacillus pumilus S118E com ação contra Staphylococcus aureus sendo necessário mais testes para confirmar a sua atividade anti-MRSA.ABSTRACT: Bacteria produce antimicrobial peptides that exhibit activity on various organisms, including Gram positive and Gram negative bacteria. Bacteriocins are low molecular weight antimicrobial peptides synthesized ribosomally, with diverse applications, such as the production of new drugs. Some bacteriocins produced by Bacillus demonstrate activity against multidrug resistant pathogens, such as methicillin resistant Staphylococcus aureus (This work aimed to identify antimicrobial compounds produced from Bacillus isolated from the soil of the Azores against Staphylococcus From 20 initial isolates, using the co inoculation with M. luteus, S. aureus and E. coli , 7 isolates were chosen that showed high antimicrobial activity. These 7 isolates were cultured in liquid medium, selecting two (S117B and S118E) that showed activity only against M. luteus The production of AMPs in liquid media was ptimized by immobilizing the producing cells on agar beads This process resulted in recovery of activity against S. aureus and increased antimicrobial activity against M. luteus , which ha d been lost when the cells were transferred from growth in solid medium to liquid medium. I solate S118E was selected as it presented more antimicrobial activity, especially against S. aureus U sing the same immobilization technique, the production of supernatant was increased. Through degradation with 5mg/mL of proteinase K and inactivation under increased temperature, it was concluded that the active compound had a proteinaceous nature. Based on this information, we guided the separation process towards small molecules of a protein nature. The culture supernatant was collected, filtered, and tested at all stages, initially by the agar diffusion method and, later, replaced by the liquid medium dilution method. The supernatant was concentrated and fractionated both by Centricon and by precipitation processes, using salts and organic solvents. The supernatant from the optimized acetone precipitation process was fractionated through the Superdex peptide 10/300 GL column, C18 resin reversed phase column and RPC reversed phase column by FPLC. Activity was collected from the Superdex column between 21 and 22 minutes, indicating molecules smaller than 5kDa. The antimicrobial activity was also eluted with 30% and 60% ace tone on the C18 column and eluted around 60% acetone on the RPC column. The highest purification was achieved with 220 purification fold and 20% recovery in sample 60% C18. It was found that the activity was not detectable at absorbance of 280nm. Both fractions analyzed by MALDI TOF MS are enriched in peptides with molecular weight between 700 and 1024 Da. Analysis of the 16S gene identified isolate S118E as Bacillus pumilus , later confirmed by genome analysis with Genomic mining resulted in 4 gene clusters with 78%, 80%, 85% and 91% similarity with clusters producing lichenisin, bacilibactin, bacillysin and plantazolicin, respectively. The presence of the pznA gene that synthesizes the plantazolicin precursor peptide and the pznC gene that synthesizes enzymes that modify this peptide was confirm ed. In this work was possible to identify bacteriocins produced by Bacillus pumilus S118E against Staphylococcus aureus, requiring further tests to confirm their anti MRSA activity.porBacillus sp.Staphylococcus sp.Péptidos antimicrobianos (AMP)BacteriocinasAçoresmaster thesis203699696