Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10400.3/2363
Título: Purificação e caracterização de moléculas com atividade antibacteriana produzidas por bactérias do género Bacillus
Autor: Sousa, Elsa Cristina Vieira de
Orientador: Cabral, Carla Manuela Machado Mendes Leite
Toubarro, Duarte Nuno
Palavras-chave: Actividade Antibacteriana
Bacillus
Bactérias
Bacteriocinas
Bacteriocin-like Inhibitory Substances (BLIS)
Antibacterial Activity
Bacteriocin
Data de Defesa: 9-Jul-2013
Citação: Sousa, Elsa Cristina Vieira de – "Purificação e caracterização de moléculas com atividade antibacteriana produzidas por bactérias do género Bacillus". Ponta Delgada : Universidade dos Açores. 2013. 63 p.. Dissertação de Mestrado.
Resumo: As bactérias produzem várias substâncias antibacterianas desde antibióticos, lisozimas, exotoxinas e também bacteriocinas. As bacteriocinas são péptidos antimicrobianos de síntese ribossomal que têm suscitado um interesse crescente no combate a estirpes resistentes a antibióticos. Algumas espécies de Bacillus produzem bacteriocinas/BLIS que possuem ação contra MRSA e outras estirpes resistentes. As aplicações das bacteriocinas vão desde a Saúde Humana até à utilização como bioconservantes. O objetivo deste trabalho foi o estudo e caracterização da atividade antibacteriana de 2 isolados de Bacillus (S54c e S150c) da Coleção Açoriana de Bactérias Esporulantes, bem como das suas moléculas ativas. Os dois isolados mostraram maior crescimento e maior atividade antibacteriana em meio Brain Heart Infusion após 18 horas de incubação. Para o sobrenadante filtrado destes isolados e para as frações ativas do sobrenadante do isolado S54c foi determinada a estabilidade térmica e a sensibilidade a enzimas hidrolíticas. O resultado destes testes foi avaliado pela determinação da atividade antibacteriana pelo método de difusão em agar contra a bactéria Micrococcus luteus. A atividade dos isolados S54c e S150C contra Staphylococcus aureus e MRSA foi avaliada pelo método descrito para bactérias esporulantes e o espectro de atividade do sobrenadante do isolado S54c foi determinado. O sobrenadante liofilizado do isolado S54c foi fracionado por cromatografia de exclusão molecular, coluna Sephacryl S-200 40 ml, e as frações positivas visualizadas em SDS-PAGE. Os sobrenadantes dos isolados S54c, S150c e a fração>30kDa do sobrenadante do isolado S54c possuem estabilidade térmica até aos 100ºC, a fração entre os 3-30kDa do isolado S54c é estável até aos 121ºC. Mostrou-se que a atividade antibacteriana dos isolados S54c, S150c e a fração>30kDa (S54c) é hidrolisada pela proteinase K e quimiotripsina, enquanto a fração entre os 3-30 kDa(S54c) apenas é hidrolisada pela proteinase K. Os resultados obtidos indicam que a atividade antibacteriana é de origem proteica e permitem classificar estas moléculas como BLIS. Os isolados S54c e S150c mostraram atividade contra S.aureus e MRSA, contudo o S150c apresentou uma atividade mais reduzida. O sobrenadante filtrado do isolado S54c mostrou atividade contra M.luteus e B.cereus e o fracionamento em cromatografia de exclusão molecular resultou na identificação de uma fração ativa. A análise da sequência parcial do gene 16S mostrou que o isolado S54c é uma estirpe de B.cereus. Este trabalho permitiu identificar parcialmente BLIS produzidas por B.cereus S54c e que podem vir a ser purificadas por técnicas cromatográficas.
ABSTRACT: Bacteria produce a high number of antibacterial molecules, including antibiotics, lisozimas, exotoxinas and bacteriocins. Bacteriocins are antimicrobial peptides of ribosomal synthesis that are raising a growing interest in the fighting against bacteria resistant strains. Some species of Bacillus produce bacteriocins/BLIS active against MRSA and other resistant strains. Bacteriocin applications are vast, from human health to biopreservatives. The objective of this work was the study and characterization of antibacterial activity of two Bacillus isolates (S54c and S150c) from the Azorean Sporulated Bacteria Collection. The two isolates showed improved growth and higher antibacterial activity in Brain Heart Infusion broth after 18 hours incubation. The antibacterial activity, of the cell free supernatant of both isolates and active fractions of S54c, were evaluated for thermal stability and degradation by hydrolytic enzymes. The results of these testes were evaluated by the agar well diffusion assay against Micrococcus luteus. S54c and S150c were tested against Staphylococcus aureus and MRSA by the method used for sporulating bacteria and the activity range of S54c cell free supernatant was determined. The freeze dried cell free supernatant of S54c was fractioned by Gel Filtration Chromatography (Sephacryl S-200 40 ml) and positive fractions were separated by SDS-PAGE. The antibacterial activity of S54c and S150c cell free supernatants and the S54c >30kDa fraction showed thermal stability until 100ºC. The S54c 3-30kDa fraction proved to be stable at 121ºC. The activity of S54c, S150c and S54c >30kDa fraction, is hydrolysed by proteinase K, chymotripsin while the 3-30 kDa(S54c) fraction is hydrolysed only by proteinase K. The results show that antibacterial activity is of protein nature and allow classifying these molecules as BLIS. The S54c and S150c isolates showed activity against S. aureus and MRSA, but S150s showed lower activity. The cell free supernatant of S54c showed activity against M. luteus and B. cereus and the gel filtration chromatography of the freeze dried cell free supernatant resulted in the identification of an active fraction. The analysis of the partial sequence of the 16S gene showed that S54c is a strain of B. cereus. This work allowed the partial fractioning and identification of BLIS produced by B. cereus S54c that can be purified by applying chromatographic techniques.
Descrição: Dissertação de Mestrado em Ciências Biomédicas.
URI: http://hdl.handle.net/10400.3/2363
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