Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10400.3/1350
Título: Estudo da actividade antimicrobiana de isolados provenientes de ambientes vulcânicos da Ilha Terceira - Açores - contra microrganismos indicadores relacionados com ambientes alimentares
Autor: Coelho, Márcia Catarina Mendes
Orientador: Dapkevicius, Maria de Lurdes Nunes Enes
Gabriel, Cristina Riquelme
Dapkevicius, Airidas
Palavras-chave: Antibióticos
Bactérias
Biologia Molecular
Data de Defesa: 12-Mar-2012
Citação: Coelho, Márcia Catarina Mendes – “Estudo da actividade antimicrobiana de isolados provenientes de ambientes vulcânicos da Ilha Terceira - Açores - contra microrganismos indicadores relacionados com ambientes alimentares”. Angra do Heroísmo : Universidade dos Açores. 2012. XII, 59 f.. Dissertação de Mestrado.
Resumo: No decurso das últimas décadas, muitas bactérias entre as quais, importantes patógenos de transmissão alimentar, adquiriram resistência aos antibióticos actualmente disponíveis, relançando a necessidade de pesquisar novas moléculas dotadas de actividade antimicrobiana. Os ambientes extremos albergam comunidades microbianas únicas, que podem ser exploradas como fontes de compostos com actividade antimicrobiana. Devido à sua natureza vulcânica, ocorrem nos Açores numerosos habitats terrestres extremos, como os tubos lávicos e as fumarolas, cujo potencial biotecnológico não foi ainda explorado. Este trabalho teve como objectivos caracterizar morfofisiologicamente isolados provenientes de biofilmes de tubos de lava - Terra Mole e Branca Opala - e de amostras de solo das fumarolas - Furnas do Enxofre; rastrear os microorganismos com actividade antimicrobiana contra microrganismos indicadores relacionados com ambientes alimentares; isolar e caracterizar preliminarmente as fracções dotadas de actividade antimicrobiana para os microrganismos com maior actividade. Estudaram-se 27 isolados provenientes de dois tubos lávicos e 3 isolados oriundos de fumarolas, situados na ilha Terceira. Todos os isolados foram caracterizados do ponto de vista morfofisiológico (morfologia das colónias, reacção ao Gram, catalase, oxidase, redução nitratos e mobilidade). A actividade antimicrobiana dos 30 isolados contra 8 microrganismos indicadores (Proteus sp., Salmonella Typhimurium ATCC 14028, E.coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococus aureus ATCC 9144, Staphylococus aureus ATCC 29523, Listeria innocua ATCC 33090, Listeria monocytogenes ATCC 7466) foi avaliada inicialmente por inoculação cruzada. Quatro isolados representativos com actividade antimicrobiana (GBO31C, GTM1B2, GBO69B e P2-1) foram seleccionados para o estudo do efeito das condições de cultivo sobre os parâmetros de crescimento (ODmax, μmax, e T.est.) e a actividade antimicrobiana, avaliada pelo ensaio de difusão em agar por inoculação em poços. Os isolados GBO31C, GTM1B2 e GBO69B foram identificados por sequenciação do gene que codificam o ARNr da subunidade 16S. O efeito do tipo de preparação da amostra (cultura inteira vs. sobrenadante) sobre a actividade antimicrobiana do isolado P2-1, foi avaliado pelo método de difusão em agar, por poços e discos. Por último procedeu-se à caracterização preliminar da actividade antimicrobiana do isolado P2-1, nomeadamente por ensaios de termoestabilidade, degradação enzimática e precipitação de proteínas com sulfato de amónio. Os 30 isolados em estudo apresentaram uma elevada diversidade fenotípica, estando representados entre eles 7 dos 16 grupos morfofisiológicos possíveis. A redução de nitratos (cerca de 40% dos isolados) e a mobilidade (23% de isolados móveis) foram frequentes. Dos isolados estudados, 77% inibiram pelo menos um dos 8 indicadores testados. No que toca aos locais de amostragem, todos os isolados obtidos a partir das fumarolas foram inibidores contra os microrganismos indicadores testados. Nos tubos lávicos, a frequência de isolados com antibiose foi superior nos tapetes amarelo e rosa. Os ensaios realizados com isolados do filo das Proteobactérias (GBO31C e GTM1B2) e isolado do género Enterococcus (GBO69B) permitiram compreender que as condições de incubação (temperatura e meio de cultura) influenciam a actividade antimicrobiana. Verificou-se também que as condições óptimas para a antibiose diferem das condições óptimas para o crescimento de cada microrganismo. A comparação dos resultados da avaliação da actividade antimicrobiana do GBO31C, GTM1B2 e P2-1 pelos métodos da inoculação cruzada e dos poços, indicou que o modo de vida em biofilme favoreceu a antibiose nestes isolados. O mesmo não se verificou em relação ao isolado GBO69B. O isolado P2-1 (G+Ox+Cat-n) apresentou actividade antimicrobiana de largo espectro. Observou-se que a remoção das células, o tratamento térmico a 100°C, a extracção por n-butanol e a adição das enzimas proteinase K, α-quimotripsina, tripsina e α-amilase não afectaram a actividade antimicrobiana deste isolado. Pelo contrário, o tratamento térmico a 121°C, com sulfato de amónio, com neutrase e a extracção com n-hexano e acetato de etilo, eliminaram a actividade antimicrobiana de culturas do P2-1. Isto indica que para a actividade antimicrobiana deste isolado deverão contribuir composto(s) proteico(s) de polaridade média. Os nossos dados indicam que as bactérias dos ambientes extremos dos Açores (ilha Terceira) poderão ser uma fonte promissora de antibióticos e de outros compostos antimicrobianos com interesse industrial.
ABSTRACT: In the recent decades, many bacteria among which important food borne pathogens, have acquired resistance to the antibiotics that are presently available, raising the need to search for novel compounds with antimicrobial activity. Extreme environments are home to unique microbial communities that can be exploited as sources of antimicrobial compounds. Due to their volcanic origin, the Azores possess countless terrestrial extreme environments, such as lava tubes and sulfur vents, whose biotechnological potential is yet to be exploited. The present work aimed at the morphophysiological characterization of isolates from biofilms in lava tubes – Terra Mole and Branca Opala - and from sulfur vents – Furnas do Enxofre, screening these isolates for their antimicrobial activity against food-related indicator microorganisms; isolating and preliminarily characterizing the anti-microbially active fractions of the most active bacteria. Twenty-seven isolates from two lava tubes and three isolates from sulfur vents located in Terceira Island (Azores, Portugal) were studied. All isolates were characterized from the morphophysiological point of view (colony morphology, Gram reaction, catalase, oxidase, nitrate reduction and motility). Antimicrobial activity of the 30 isolates was initially studied against 8 indicator microorganisms (Proteus sp., Salmonella Typhimurium ATCC 14028, E.coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococus aureus ATCC 9144, Staphylococus aureus ATCC 29523, Listeria innocua ATCC 33090, Listeria monocytogenes ATCC 7466) by the cross-streak assay. Four representative isolates with antimicrobial activity (GBO31C, GTM1B2, GBO69B and P2-1) were selected for studying the effect of cultivation conditions on their growth parameters (ODmax, μmax, e T.est.) and on their antimicrobial activity, evaluated by the well-assay. Identification of the isolates GBO31C, GTM1B3 and GBO69B was attempted by sequencing the genes that code for rRNA from the 16S subunit. The effect of sample preparation (whole culture vs. cell-free supernatant) on the antimicrobial activity of isolate P2-1 was evaluated by the well-assay and disk assay methods. Finally, preliminary characterization of the antimicrobial activity of cell-free supernatants from P2-1 was carried out by testing the effect of heat, enzymes, and ammonium sulfate precipitation. The 30 isolates under study displayed considerable phenotypic diversity, with 7 of the 16 possible morphological groups represented. Nitrate reduction and motility were frequent. Seventy-seven percent of the studied isolates inhibited at least one of the 8 indicators tested. Concerning the sampling locations, all isolates from sulfur vents were inhibitory against the tested pathogens. In lava tubes, the frequency of antibacterial isolates was higher in the yellow and pink mats when compared with white and tan biofilms. Tests carried out in two isolates belonging to the Proteobacteria (GBO31C and GTM1B2) and one Enterococcus isolate (GBO69B) showed that cultivation conditions (temperature and culture media) influenced their antimicrobial activity. It was also observed that optimal conditions for antibiosis differ from the optimal conditions for growth in the tested organisms. Comparison of the results of the evaluation of antimicrobial activity of GBO31C, GTM1B2 and P2-1 by the cross-streak and well-assay methods indicated that the biofilm lifestyle enhanced antibiosis in these isolates. The same did not occur for isolate GBO69B. Isolate P2-1 (G+Ox+Cat-n) displayed broad-spectrum antimicrobial activity. In this isolate, removing the cells from the spent culture, heat treatment at 100°C, extraction with n-butanol and addition of proteinase K, α-chemotrypsin, trypsin and α-amylase did not affect antimicrobial activity, whereas thermal treatment at 121°C, precipitation with ammonium sulfate, treatment with neutrase, extraction with n-hexane and ethyl acetate eliminated the antibiosis effect. This indicates that mid-polarity proteic compound(s) contribute to the antimicrobial activity of P2-1. Our data show that bacterial isolates from Azorean (Terceira Island) extreme environments hold potential as a source of novel antibiotics and other antimicrobial compounds of industrial interest.
Descrição: Dissertação de Mestrado em Tecnologia e Segurança Alimentar.
URI: http://hdl.handle.net/10400.3/1350
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