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Título: Caracterização molecular de Listeria monocytogenes ser. 4b por Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)
Autor: Goulão, Maria Manuela Martins Francisco
Orientador: Pintado, Cristina Maria Baptista Santos
Ferreira, Maria Adélia da Silva Santos
Palavras-chave: Listeria monocytogenes
Biologia Molecular
Queijo
Marcador Geográfico
Cheese
Geographical Marker
Molecular Biology
Data de Defesa: 3-Mar-2011
Resumo: O serotipo maioritariamente associado às estirpes de Listeria monocytogenes isoladas de queijos Portugueses pertence ao serotipo 4b, o qual está referido na literatura como o responsável pelo maior número de casos de listeriose humana. Tendo em conta a importância de que se revestem estas estirpes, a sua caracterização usando métodos mais discriminatórios que a serotipagem é de crucial importância. Assim, o presente estudo teve por finalidade a caracterização molecular de estirpes de L. monocytogenes ser. 4b, isoladas de queijos de diferentes zonas do país, e uma primeira avaliação da distribuição geográfica dos tipos moleculares encontrados. Foi usado o método Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) com base no protocolo que se encontra em funcionamento no Health Protection Agency Department of Gastrointestinal Infections / Centre for Infections, em Londres. Para a análise da similaridade entre estirpes recorreu-se ao programa Bionumerics. O poder discriminatório do método AFLP foi calculado através do índice de Simpson. Das 47 estirpes de L. monocytogenes ser. 4b tipadas neste trabalho resultaram 6 perfis diferentes com um número de bandas compreendido entre 5 a 7 no intervalo entre 500 bp e 1500 bp. Todos os perfis AFLP apresentaram uma banda comum de aproximadamente 850 bp. O poder discriminatório do método AFLP foi avaliado em 0,70. Pela análise do dendrograma observou-se a existência de 6 clusters para uma percentagem de similaridade de 98%, os quais foram agrupados de acordo com o tipo AFLP previamente atribuído. A relação de similaridade mais afastada encontrada entre os 47 isolados foi de 67%. Considerando a totalidade dos isolados provenientes da região da Serra da Estrela, foi possível identificar 5 tipos AFLP, quatro dos quais identificados apenas naquela zona e um quinto tipo AFLP com uma distribuição geográfica alargada (Serra da Estrela, Serpa e São Jorge), o que contraria a sua utilização como marcador geográfico. Comparando estes 47 perfis com os obtidos anteriormente pelo mesmo método usando isolados provenientes das zonas produtoras de queijo de Castelo Branco e Tolosa (n=61), concluise que os tipos AFLP obtidos são diferentes, não havendo tipos AFLP comuns entre as zonas de Tolosa, Castelo Branco e Serra da Estrela, indicando uma associação entre um determinado tipo AFLP de L. monocytogenes ser. 4b e cada uma destas regiões.
ABSTRACT: The serotype more frequently associated with Listeria monocytogenes strains isolated from Portuguese cheeses belongs to serotype 4b, which is reported as responsible for the largest number of human listerioses outbreaks. Given the importance of these strains, their characterization by more discriminatory methods than serotyping is of crucial importance. Thus, the aim of the present study was the molecular characterization of strains of L. monocytogenes ser. 4b, isolated from cheese from different parts of the country, and the assessment of the geographical distribution of molecular types found. Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) method was used based onto a protocol that is in operation at the Health Protection Agency Department of Gastrointestinal Infections / Centre for Infections in London. Cluster analysis was performed using the Bionumerics software. The discriminatory power of AFLP method was calculated using the Simpson index. The 47 strains of L. monocytogenes ser. 4b typed in this work resulted in six different profiles with 5-7 bands in the range between 500 bp and 1500 bp. All AFLP profiles showed a common band of about 850 bp. The discriminatory power of AFLP method was calculated in 0.70. The analysis of the dendrogram showed the existence of six clusters for a percentage of similarity of 98%, which were grouped according to the AFLP previously assigned. The similarity relation farthest found among 47 isolates was 70%. Considering all of the isolates from Serra da Estrela, it was possible to identify five types AFLP, four of them identified only in that area and a fifth AFLP with a wide geographical distribution (Serra da Estrela, Serpa and São Jorge), which dissuaded its use as a geographic marker. Comparing these 47 profiles with those obtained previously by the same method and isolated from cheese production areas of Castelo Branco and Tolosa (n = 61), we conclude that the obtained AFLP types are different, with no common AFLP types among the areas of Tolosa, Castelo Branco and Serra da Estrela, indicating an association between a particular AFLP type of L. monocytogenes ser. 4b and each one of these regions of cheese production.
Descrição: Dissertação de Mestrado em Engenharia Zootécnica.
URI: http://hdl.handle.net/10400.3/1093
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